Summary

Análise mosaico de função do gene em desenvolvimento pós-natal do rato do cérebro usando Virus baseado Recombinação Cre

Published: August 01, 2011
doi:

Summary

Um<em> In vivo</em> Método para testar a função do gene no cérebro pós-natal é descrito. AAVs recombinante expressando Cre e / ou uma proteína fluorescente são injetadas no cérebro de rato neonatal. Inativação do gene mosaico e rotulagem neuronal esparsos são alcançados, permitindo a análise rápida da função dos genes em processos críticos para o desenvolvimento do circuito neural.

Abstract

Função normal do cérebro depende não só no desenvolvimento embrionário quando principais vias neuronais são estabelecidas, mas também sobre o desenvolvimento pós-natal quando os circuitos neurais são vencidas e refinado. Desregulação nesta fase pode levar a distúrbios neurológicos e psiquiátricos, como autismo e esquizofrenia 1,2. Muitos genes foram estudados no cérebro pré-natal e encontrou crucial para muitos processos de desenvolvimento 3-5. No entanto, sua função no cérebro pós-natal é em grande parte desconhecida, em parte porque sua eliminação em ratos muitas vezes leva a letalidade durante o desenvolvimento neonatal, e em parte porque sua exigência no início do desenvolvimento dificulta a análise pós-natal. Para superar esses obstáculos, os alelos floxed desses genes estão sendo gerados em camundongos 6. Quando combinado com alelos transgênicos que expressam Cre recombinase em tipos específicos de células, eliminação condicional pode ser alcançado para estudar a função do gene no cérebro pós-natal. No entanto, este método requer alelos adicionais e tempo extra (3-6 meses) para gerar os ratos com genótipos adequados, limitando assim a expansão da análise genética para grande escala no cérebro do rato.

Aqui nós demonstramos uma abordagem complementar que usa Cre virally-expresso para o estudo desses alelos floxed rápida e sistematicamente no desenvolvimento do cérebro pós-natal. Injetando recombinante vírus adeno-associado (rAAVs) 7,8 codificação Cre no cérebro neonatal, somos capazes de eliminar o gene de interesse em diferentes regiões do cérebro. Ao controlar o título viral e coexpressing um marcador da proteína fluorescente, que pode assegurar em simultâneo a inativação do gene mosaico e rotulagem neuronal esparsas. Este método ignora a exigência de muitos genes no início do desenvolvimento, e nos permite estudar a sua função de células autônomas em muitos processos críticos no desenvolvimento do cérebro pós-natal, incluindo o crescimento axonal e dendrítico, ramificação e azulejos, bem como a formação de sinapses e requinte. Este método tem sido utilizado com sucesso em nosso próprio laboratório (dados não publicados) e outros 8,9, e pode ser estendido a outros vírus, como lentivírus 9, bem como a expressão de shRNA ou dominante proteínas ativas 10. Além disso, ao combinar esta técnica com eletrofisiologia, bem como recém-desenvolvidas ferramentas de imagem óptico de 11, este método fornece uma nova estratégia para estudar como as vias genéticas influenciam o desenvolvimento do circuito neural e função em camundongos e ratos.

Protocol

1. Vírus Preparação para a injecção rAAVs foram comprados do fornecedor recomendado comercial, mas também podem ser produzidos em um laboratório do próprio (ver discussão abaixo). A solução vírus normalmente é produzido em um título de ~ 1×10 12 cópias do genoma por mililitro (GC / ml) e pode ser usado na titulação completa para manipular um grande número de células. Alternativamente, eles podem ser diluídas para produzir o nível desejado de rotulagem esparsas. Uma diluição a…

Discussion

O método de injeção neonatal viral apresentado aqui fornece uma maneira simples e rápida de gerar em mosaicos vivo para o estudo do desenvolvimento do cérebro pós-natal. O método aproveita floxed alelos que estão atualmente disponíveis, bem como aqueles que estão sendo feitas através do Gene High Throughput Segmentação do projeto 6. Comparado ao uso da expressão transgênica de Cre, este método fornece uma maneira rápida de testar a função do gene em vários tipos celulares…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado por uma bolsa de RO1 NIH (NINDS).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, Vector Biolabs #7060, #7061, custom order http://www.vectorbiolabs.com
Harvard Pump 11 Plus Harvard Apparatus #702208 (No foot pedal port)
Retinal Pigment Epithelium Injection Kit World Precision Instruments RPE-KIT Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder
NanoFil Syringe, 100μl World Precision Instruments NANOFIL-100 Includes reusable loading needle
D-PBS Invitrogen 14040-117  
GFP antibody Aves GFP-1020  
DsRed antibody Clontech 632496  
Heating Block VWR 97042-610  
ROSA26R mouse Jackson Laboratory 003309  

References

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Cite This Article
Gibson, D. A., Ma, L. Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination. J. Vis. Exp. (54), e2823, doi:10.3791/2823 (2011).

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