פסיפס ניתוח פונקציה ג'ין בפיתוח עכבר אחרי לידה המוח על ידי שימוש וירוס מבוססי רקומבינציה Cre
Summary
<em> In vivo</em> שיטת לבדוק תפקוד הגנים במוח לאחר הלידה מתוארת. AAVs רקומביננטי להביע Cre ו / או חלבון פלואורסצנטי מוזרקים במוח העכבר הילוד. גן פסיפס איון וסימון העצבית דלילה מושגות, דבר המאפשר ניתוח מהיר של תפקוד הגן בתהליכים קריטיים לפיתוח מעגלים עצביים.
Abstract
תפקוד המוח רגיל נשענת לא רק על ההתפתחות העוברית כאשר מסלולים עצביים העיקריים מבוססים, אלא גם על התפתחות הלידה, כאשר מעגלים עצביים הם הבשילו ומעודן. Misregulation בשלב זה עשויה להוביל להפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות כגון סכיזופרניה, אוטיזם 1,2. גנים רבים נחקרו במוח טרום לידתי ומצא חיוני לתהליכים התפתחותיים רבים 3-5. עם זאת, תפקידם במוח לאחר הלידה אינו ידוע ברובו, בין השאר משום המחיקה שלהם בעכברים מובילה לעיתים קרובות הקטלניות במהלך התפתחות הילוד, וגם מפני הדרישה שלהם בהתפתחות המוקדמת מעכבת את הניתוח לאחר הלידה. כדי להתגבר על המכשולים הללו, floxed האללים של גנים אלה נמצאים בשלבי שנוצר בעכברים 6. בשילוב עם אללים מהונדס המבטאים Cre recombinase ב סוגי תאים מסוימים, המחיקה מותנית יכולה להיות מושגת ללמוד לתפקד גנים במוח לאחר הלידה. עם זאת, שיטה זו דורשת אללים נוספים תוספת זמן (3-6 חודשים) על מנת ליצור את העכברים עם גנוטיפים המתאימים, וכך להגביל את הרחבת הניתוח גנטית בקנה מידה גדול במוח העכבר.
כאן אנו משלימים להפגין גישה המשתמשת Cre virally-הביעו ללמוד אלה אללים floxed במהירות ובאופן שיטתי בהתפתחות המוח לאחר הלידה. באמצעות הזרקת רקומביננטי adeno הקשורים וירוסים (rAAVs) 7,8 קידוד Cre לתוך המוח בילוד, אנו מסוגלים למחוק את הגן של עניין באזורים שונים של המוח. על ידי שליטה על כייל ויראלי coexpressing סמן חלבון פלואורסצנטי, אנחנו יכולים להשיג בו זמנית גן פסיפס איון וסימון העצבית דלילה. שיטה זו עוקפת את הדרישה של גנים רבים בפיתוח מוקדם, מאפשר לנו ללמוד תפקוד התא האוטונומי שלהם תהליכים קריטיים רבים בהתפתחות המוח לאחר הלידה, כולל צמיחה axonal ו דנדריטים, מסתעפת, ו ריצוף, וכן היווצרות הסינפסה ועידון. שיטה זו שימש בהצלחה במעבדה שלנו (תוצאות לא פורסם) ואחרים 8,9, ו – ניתן להרחיב וירוסים אחרים, כגון 9 lentivirus, כמו גם לביטוי של חלבונים או shRNA פעיל דומיננטי 10. יתר על כן, על ידי שילוב של טכניקה זו עם electrophysiology וכן לאחרונה פיתחה כלי הדמיה אופטית 11, שיטה זו מספקת אסטרטגיה חדשה ללמוד איך מסלולים גנטיים המשפיעים על התפתחות המעגל העצבי לתפקד וגם עכברים וחולדות.
Protocol
Discussion
השיטה בילוד הזרקת נגיפי המוצג כאן מספק דרך פשוטה ומהירה ליצור בפסיפסים vivo לחקר התפתחות המוח לאחר הלידה. השיטה מנצלת אללים floxed הזמינים כעת וכן אלה הנעשים דרך הגן תפוקה גבוהה מיקוד הפרויקט 6. לעומת השימוש בביטוי מהונדס של Cre, שיטה זו מספקת דרך מהירה לבדוק את ת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענק RO1 מ-NIH (NINDS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech | 632496 | |
| Heating Block | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?. Neuron. 67, 728-734 (2010).
- Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
- Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
- Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
- Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. 神经科学. 138, 501-510 (2006).
- Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
- Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
- Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).
