利用基于病毒的Cre重组马赛克产后小鼠脑开发基因功能分析
Summary
一个<em>在体内</em>产后脑的方法来测试基因功能描述。表达CRE和/或荧光蛋白的重组自动增值服务注入新生小鼠大脑。马赛克基因的失活和稀疏的神经标签实现，使神经电路的发展过程的关键基因功能的快速分析。
Abstract
不仅依赖于胚胎发育的主要神经通路建立正常的脑功能，但也发育时神经回路的成熟和完善。 Misregulation在这个阶段，可能会导致神经和精神疾病，如自闭症和精神分裂症1,2。许多基因已在胎儿的大脑研究，发现许多 3-5发育过程至关重要。然而，他们在出生后大脑功能在很大程度上是未知的，部分原因是因为他们在小鼠的缺失往往会导致新生儿发育期间，以杀伤力，部分原因是因为他们在早期发展的要求，阻碍了产后的分析。为了克服这些障碍，这些基因的floxed等位基因，目前正在生成在小鼠 6 。当结合表达Cre重组酶在特定的细胞类型，有条件的删除，可以实现在产后的大脑研究基因功能的转基因等位基因。然而，这种方法需要额外的等位基因和额外的时间（3-6个月），以产生适当的基因型的小鼠，从而限制了在鼠脑大规模扩展的遗传分析。
在这里，我们展示了一个互补的方法，使用病毒的表达Cre重组迅速，系统地研究这些floxed等位基因在出生后大脑发育。通过注入重组腺相关病毒（rAAVs）7,8编码的Cre新生儿的大脑，我们可以删除该基因在大脑的不同区域的利益。通过控制病毒滴度和共表达荧光蛋白标记，我们可以同时实现镶嵌基因的失活和稀疏神经元的标签。这种方法绕过了许多基因在早期发展的要求，使我们能够学习他们的细胞自主的功能在许多关键的过程，在出生后大脑发育，包括轴突和树突状增长，分支，和平铺，以及突触的形成和完善。该方法已成功地使用在我们自己的实验室（未公布结果）和其他8,9，并可以扩展到其他的病毒， 如 9，以及慢病毒的shRNA或主导活性蛋白 10的表达，。此外，通过与电相结合的技术，以及最近开发的光学成像工具11，这种方法提供了一个新的战略，以研究如何遗传途径影响神经电路的发展和在小鼠和大鼠的功能。
Protocol
Discussion
这里介绍的新生儿病毒注射方法提供了一个简单而快速的方式来产生体内马赛克产后大脑发育的研究。该方法需要利用floxed等位基因目前可用的，以及那些正在通过高通量基因靶向项目6。使用Cre转基因表达相比，这种方法提供了一种快速的方法来测试基因在不同细胞类型的功能，携带floxed等位基因的小鼠可直接用于实验，整个病毒注射过程从开始到结束，可在不到一小时完成。此?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由来自美国国立卫生研究院研究所（NINDS）RO1的赠款支持。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech | 632496 | |
| Heating Block | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
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