Количественная оценка Белки Использование пептидов обогащению иммуноаффинной В сочетании с масс-спектрометрии
Summary
Стабильный Стандарты Изотопные и Capture Анти-пептидов Антитела (SISCAPA) пары близость обогащение пептиды со стабильной изотопного разбавления масс-спектрометрии (MRM-MS) для обеспечения количественного определения пептидов в качестве суррогатов для соответствующих белков. Здесь мы опишем протокол с использованием магнитных частиц в частично автоматизированные формате.
Abstract
Существует большая потребность в количественных тестов при измерении белков. Традиционные иммунологические сэндвич, в значительной степени считается золотым стандартом в количественной, связаны с высокой стоимостью, долгое время свинца и чреваты недостатки (например, гетерофильных антител, аутоантител помех, "крюк-эффект») 1. Альтернативная методика является близость обогащения пептидов в сочетании с количественной масс-спектрометрии, как правило, называют SISCAPA (Стабильный Стандарты Изотопные и Capture Анти-пептидов Антитела) 2. В этой технике, близость обогащение пептиды со стабильной изотопного разбавления и обнаружения по отдельным / множественные реакции мониторинг масс-спектрометрии ( SRM / MRM-MS) обеспечивает количественное измерение пептидов в качестве суррогатов для соответствующих белков. SRM / MRM-МС хорошо установлена для точного количественного определения малых молекул, 3, 4 и совсем недавно был адаптирован для измерения концентрации белков в плазме крови и клеточных лизатов. 5-7 Для достижения количественного определения белков, эти крупные молекулы перевариваются до Компонент пептидов использованием ферментов, таких как трипсин. Один или несколько выбранных пептиды, последовательность является уникальным для целевого белка в том, что виды (например, "proteotypic" пептидов) затем обогащенный из примера с использованием анти-пептидных антител и измеряется как количественными суррогаты для стехиометрической концентрации белка в образце. Таким образом, в сочетании с стабильным изотопного разбавления (SID) методов (например, шипами в стабильный изотоп меченый пептид стандарт), SRM / MRM может быть использован для измерения концентрации proteotypic пептидов в качестве суррогатов для количественного определения белков в сложных биологических матриц. Методы имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными иммуноанализа. Реагенты сравнительно дешевле генерировать, специфичность для аналита отлично, анализы могут быть очень мультиплексированных, обогащение может быть выполнена с аккуратным плазмы (без истощения требуется), и техника поддается широкий спектр белков или модификации интересов. 8-13 В этом видео мы демонстрируем основной протокол, как адаптировать к магнитной бусины платформы.
Protocol
Discussion
Наиболее важным шагом в протокол, как описано, является обеспечение бисером остаются хорошо перемешанных в течение инкубационного периода. Разрешение бисером осели на дно колодца / флакон приведет к увеличению изменчивости. Важно также, чтобы спин-вниз любой жидкости, которые могут остаться на вершине и / флакон следующие инкубационного периода. Воспроизводимые пищеварения трипсина также имеет важное значение. Процедуры для пищеварения, описанные здесь был использован широко в нашей лаборатории совместно с SISCAPA, однако, вполне вероятно, альтернативные методы пищеварения может быть оптимизирована для данного набора белков-мишеней 15 Элюирование свободных антител не мешает обнаружению. пептид, вероятно, потому что антитела, исключается из столбца или элюируется позднее пептидов, но антитела могут быть сшиты с гранулами Protein G до близости обогащения в крупных экспериментов или при наличии свободных антител становится проблемой. Кроме того, мы сочли целесообразным поместить магнит ниже образец пластина на автосамплером а также стирку ловушку колонки в обратном направлении потока (по сравнению с загрузкой), чтобы удалить остатки бисера или частиц. В дополнение к магнитной бусины подход, описанный, метод также может быть адаптирована к колонке формате (т.е. аффинная хроматография). 12, 16
После того как пользователь комфортно с общим протоколом, техника также поддаются несколько модификаций, которые повышают общий анализ. 11-первых, это возможность анализировать несколько аналитов в одном анализе, комбинируя антитела в обогащении шаг (т.е. мультиплексирование). Масс-спектрометр, способный одновременно анализировать большое количество аналитов. Во-вторых, увеличение объема исходного образца повышает чувствительность анализа.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась NCI Клинические протеомных технологии Assessment Center (CPTAC) гранта (# U24 CA126476), а также грант от индустрии развлечений Foundation (РКРП) и Cancer Research EIF Женский фонд для биомаркеров груди Консорциум Discovery Рака, и щедрые подарки от фонда Кека, Канарские Фонда и Пол Г. Аллен Фонд семьи.
Materials
| Name of the material | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific | 97002540 |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 |
| Foil cover for 96 well plate | Excelscientific | 12-169 |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen | 521-01-151 |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific | HSP 9601 |
Table 1: Materials
| Name of the material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Urea | Sigma Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce | 20291 | “no-weigh dithiothreitol” |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific | 28300 | |
| Formic acid | EMD | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 242853 |
Table 2: Reagents
| Solution | Comments (optional) |
|---|---|
| 100 mM Tris pH 8 | |
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
| Stable isotope standard mastermix | |
| Anti-peptide antibody mastermix |
Table 3: Solutions to be prepared
References
- Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry. J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).
- Anderson, N. L. Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA). J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).
- Chace, D. H., Kalas, T. A. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).
- Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization. Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).
- Barr, J. R. Isotope dilution–mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I. Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).
- Kuhn, E. Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards. Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).
- Whiteaker, J. R. Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers. Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).
- Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry. Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).
- Kuhn, E. Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry. Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).
- Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers. Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).
- Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen. Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).
- Ackermann, B. L., Berna, M. J. Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers. Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).
- MacLean, B. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Proc, J. L. A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).
- Berna, M. Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation. Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).
