כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה
Summary
תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיות חלקית.
Abstract
יש צורך גדול מבחני כמותי למדידת חלבונים. Immunoassays כריך מסורתית, נחשב במידה רבה את תקן הזהב ב quantitation, קשורים עם עלות גבוהה, זמן להוביל ארוך, והם טומנת בחובה חסרונות (נוגדנים heterophilic למשל, התערבות autoantibody, "וו אפקט"). 1 טכניקה חלופית היא העשרה זיקה של פפטידים יחד עם ספקטרומטריית מסה כמותית, המכונות גם SISCAPA (איזוטופ יציב סטנדרטים ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים). 2 בטכניקה זו, העשרה זיקה של פפטידים עם דילול איזוטופ יציב זיהוי על ידי נבחרת / מרובות ניטור התגובה ספקטרומטריית מסה ( SRM / MRM-MS) מספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. SRM / MRM-MS היא מבוססת היטב על quantitation מדויק של מולקולות קטנות, 3, 4 ולאחרונה הותאם למדידת ריכוזים של חלבונים בפלסמה lysates התא. 5-7 כדי להשיג quantitation של חלבונים, מולקולות אלה גדול מתעכלים עד פפטידים רכיב באמצעות אנזים כגון טריפסין. אחד או יותר פפטידים אשר נבחר רצף ייחודי חלבון היעד מינים (כלומר "proteotypic" פפטידים) מועשרים אז מן המדגם באמצעות פפטיד אנטי נוגדנים, כפי שהיא נמדדת בתחליפים stoichiometric כמותי ריכוז חלבון במדגם. לפיכך, מצמידים את דילול איזוטופ (SID) שיטות יציב (כלומר זינק ב-איזוטופ יציב הנקרא פפטיד סטנדרטי), SRM / MRM ניתן להשתמש כדי למדוד ריכוזים של פפטידים proteotypic כתחליפי עבור וכימות של חלבונים מטריצות ביולוגיות מורכבות. מבחני יש כמה יתרונות לעומת immunoassays המסורתית. ריאגנטים הם יחסית פחות יקר לייצר, הספציפיות עבור אנליטי הוא מעולה, מבחני ניתן multiplexed מאוד, העשרה ניתן לבצע מפלסמה מסודר (דלדול לא חובה), ואת הטכניקה ניתנת מגוון רחב של חלבונים או שינויים של עניין. 8-13 בסרטון הזה אנחנו מדגימים את פרוטוקול בסיסי המותאם פלטפורמה חרוז מגנטי.
Protocol
Discussion
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול כפי שתואר הוא הבטחת החרוזים להישאר היטב מעורבת במהלך תקופת הדגירה. מתן חרוזים כדי ליישב לתחתית הבאר / בקבוקון תגרום השתנות מוגברת. חשוב גם ספין למטה נוזלי העלול להישאר בחלק העליון של הבאר / בקבוקון לאחר תקופת הדגירה. העיכול טריפסין לשחזור גם קריטי. ההליך המתואר כאן לעיכול נוצל באופן נרחב בשיתוף עם SISCAPA במעבדה שלנו, עם זאת, הוא בשיטות חלופיות סביר של מערכת העיכול יכול להיות מותאם עבור קבוצה מסוימת של חלבונים יעד 15 elution של נוגדן חופשי לא להפריע לזיהוי של. הפפטיד, סביר להניח כי את הנוגדן אינו נכלל מהעמודה או elutes יאוחר פפטידים, אבל את הנוגדן ניתן crosslinked את חרוזי חלבון G לפני העשרה זיקה בניסויים גדול או אם נוגדן חופשי הופך לבעיה. מצאנו גם את זה שימושי למקום מגנט מתחת לצלחת מדגם על autosampler כמו גם שטיפת העמודה מלכודת בכיוון ההפוך של הזרימה (לעומת טעינה) כדי להסיר כל החרוזים שיורית או חלקיקים. בנוסף הגישה חרוז מגנטי המתואר, הטכניקה ניתן גם להתאים לתבנית עמודה (כלומר זיקה כרומטוגרפיה). 12, 16
לאחר שהמשתמש מרגיש נוח עם פרוטוקול הכולל, הטכניקה היא גם מקובל מספר שינויים המשפרים את assay הכוללת. 11 ראשית, ניתן לנתח analytes מרובים assay אחת על ידי שילוב של נוגדנים בשלב העשרה (כלומר ריבוב). ספקטרומטר מסה הוא מסוגל לנתח בו זמנית מספר גדול של analytes. שנית, הגדלת נפח המדגם המקורי משפרת את הרגישות של assay.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי קלינית NCI proteomic Technology Assessment מרכז (CPTAC) מענק (# U24 CA126476) וכן מענק מקרן תעשיית הבידור (EIF) ו לחקר הסרטן הנשים EIF הקרן הקונסורציום סרטן השד סמן דיסקברי, ו מתנות נדיבה מקרן קק, קרן הקנריים, ואת ג'פול אלן הקרן המשפחתית.
Materials
| Name of the material | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific | 97002540 |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 |
| Foil cover for 96 well plate | Excelscientific | 12-169 |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen | 521-01-151 |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific | HSP 9601 |
Table 1: Materials
| Name of the material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Urea | Sigma Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce | 20291 | “no-weigh dithiothreitol” |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific | 28300 | |
| Formic acid | EMD | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 242853 |
Table 2: Reagents
| Solution | Comments (optional) |
|---|---|
| 100 mM Tris pH 8 | |
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
| Stable isotope standard mastermix | |
| Anti-peptide antibody mastermix |
Table 3: Solutions to be prepared
References
- Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry. J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).
- Anderson, N. L. Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA). J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).
- Chace, D. H., Kalas, T. A. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).
- Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization. Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).
- Barr, J. R. Isotope dilution–mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I. Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).
- Kuhn, E. Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards. Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).
- Whiteaker, J. R. Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers. Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).
- Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry. Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).
- Kuhn, E. Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry. Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).
- Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers. Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).
- Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen. Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).
- Ackermann, B. L., Berna, M. J. Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers. Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).
- MacLean, B. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Proc, J. L. A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).
- Berna, M. Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation. Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).
