Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie
Summary
Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.
Abstract
Er is een grote behoefte aan kwantitatieve bepalingen in het meten van eiwitten. Traditionele sandwich immunoassays, grotendeels beschouwd als de gouden standaard in kwantificatie, zijn geassocieerd met een hoge kosten, lange doorlooptijd, en zijn vol nadelen (bijv. heterofiele antilichamen, autoantilichaam interferentie, 'hook-effect'). 1 Een alternatieve techniek is affiniteit verrijking van peptiden gekoppeld aan kwantitatieve massaspectrometrie, meestal aangeduid als SISCAPA (stabiele isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antistoffen). 2 In deze techniek, affiniteit verrijking van peptiden met een stabiele isotoop verdunning en detectie door de geselecteerde / meerdere monitoren reactie massaspectrometrie ( SRM / MRM-MS) biedt kwantitatieve meting van peptiden als surrogaten voor hun respectievelijke eiwitten. SRM / MRM-MS is goed ingeburgerd voor een accurate kwantificering van kleine moleculen 3, 4 en meer recentelijk is aangepast aan de concentraties van eiwitten te meten in plasma en cellysaten. 5-7 Om kwantificatie van eiwitten te bereiken, zijn deze grotere moleculen verteerd tot component peptiden met behulp van een enzym, zoals trypsine. Een of meer geselecteerde peptiden waarvan de sequentie uniek is voor het doelwit eiwit in dat soort (dwz "proteotypic" peptiden) worden vervolgens verrijkt door het monster met behulp van anti-peptide antilichamen en gemeten als kwantitatieve stoichiometrische surrogaten voor eiwit-concentratie in het monster. Vandaar dat, gekoppeld aan stabiele isotoop verdunning (SID) methoden (dat wil zeggen een spiked-in stabiele isotoop gelabeld peptide-standaard), SRM / MRM kan worden gebruikt om concentraties van proteotypic peptiden te meten als surrogaat voor de kwantificering van de eiwitten in complexe biologische matrices. De assays hebben verschillende voordelen ten opzichte van traditionele immunoassays. De reagentia zijn relatief minder duur om te genereren, de specificiteit voor de analyt is uitstekend, de testen kunnen sterk worden gemultiplext, kan verrijking worden uitgevoerd vanaf nette plasma (geen uitputting vereist), en de techniek vatbaar is voor een breed scala aan eiwitten of wijzigingen van belang zijn. 8-13 In deze video zien we de basis-protocol, zoals aangepast aan een magnetisch bolletje platform.
Protocol
Discussion
De meest kritische stap in het protocol, zoals beschreven is het waarborgen van de kralen blijven goed gemengd tijdens de incubatieperiode. Het toestaan van de kralen om zich te vestigen op de bodem van de put / flacon zal resulteren in een verhoogde variabiliteit. Het is ook belangrijk om spin-down vloeistof die kan blijven op de top van de goed / flacon na de incubatietijd. Reproduceerbare trypsine spijsvertering is ook kritisch. De procedure voor de spijsvertering hier beschreven is uitgebreid gebruikt in ons laboratorium in combinatie met SISCAPA, maar is het waarschijnlijk alternatieve methoden van de spijsvertering kunnen worden geoptimaliseerd voor een bepaalde set van target eiwitten 15 Elutie van vrije antilichaam niet interfereren met de detectie van de. peptide, waarschijnlijk omdat het antilichaam is uitgesloten van de kolom of elueert later dan de peptiden, maar het antilichaam kan worden verknoopt aan de Proteïne G kralen voorafgaand aan de affiniteit verrijking in grote experimenten of als vrij antilichaam wordt een probleem. We hebben ook vonden het nuttig om een magneet onder het monster plaat op de autosampler evenals het wassen van de val kolom in de omgekeerde richting van de stroom (in vergelijking met het laden van) plaats om eventuele resten van kralen of deeltjes te verwijderen. In aanvulling op de magnetische kraal beschreven aanpak, kan de techniek ook worden aangepast aan een kolom formaat (dat wil zeggen affiniteitschromatografie). 12, 16
Zodra de gebruiker is comfortabel met de algemene protocol, de techniek is ook vatbaar voor een aantal wijzigingen die de algemene test te verbeteren. 11 Ten eerste is het mogelijk om meerdere analyten te analyseren in een enkele assay door het combineren van antilichamen in de verrijking stap (dwz multiplexing). De massaspectrometer is in staat om gelijktijdig te analyseren een groot aantal analyten. Ten tweede, het verhogen van het volume van de oorspronkelijke monster verbetert de gevoeligheid van de test.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de NCI Clinical Proteoom Technology Assessment Center (CPTAC) beurs (# U24 CA126476), evenals een subsidie van de Entertainment Industry Foundation (EIF) en de EIF Women's Cancer Research Fund aan de Breast Cancer Biomarker Discovery Consortium, en gulle giften van de Keck Foundation, de Canarische Foundation, en de Paul G. Allen Family Foundation.
Materials
| Name of the material | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific | 97002540 |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 |
| Foil cover for 96 well plate | Excelscientific | 12-169 |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen | 521-01-151 |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific | HSP 9601 |
Table 1: Materials
| Name of the material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Urea | Sigma Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce | 20291 | “no-weigh dithiothreitol” |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific | 28300 | |
| Formic acid | EMD | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 242853 |
Table 2: Reagents
| Solution | Comments (optional) |
|---|---|
| 100 mM Tris pH 8 | |
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
| Stable isotope standard mastermix | |
| Anti-peptide antibody mastermix |
Table 3: Solutions to be prepared
References
- Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry. J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).
- Anderson, N. L. Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA). J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).
- Chace, D. H., Kalas, T. A. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).
- Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization. Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).
- Barr, J. R. Isotope dilution–mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I. Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).
- Kuhn, E. Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards. Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).
- Whiteaker, J. R. Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers. Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).
- Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry. Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).
- Kuhn, E. Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry. Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).
- Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers. Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).
- Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen. Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).
- Ackermann, B. L., Berna, M. J. Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers. Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).
- MacLean, B. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Proc, J. L. A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).
- Berna, M. Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation. Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).
