펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께
Summary
안정 동위 원소 표준 및 안티 펩타이드 항체 (SISCAPA) 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공하기 위해 안정 동위 원소 희석 질량 분석법 (MRM – MS)과 펩티드의 커플 선호도 농축하여 캡처합니다. 여기서 우리는 부분적으로 자동화된 형식으로 자기 입자를 사용하여 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
단백질을 측정 양적 assays에 대한 큰 필요가있다. 크게 quantitation의 황금 표준으로 간주 전통 샌드위치 immunoassays은, 높은 비용, 긴 리드 타임과 관련된, 그리고 단점 (예 : heterophilic 항체, autoantibody 간섭 '후크 효과')이 따른 다네입니다. 한 대체 기술 친화 농축집니다 양적 질량 분광법과 결합 펩티드의 일반적 SISCAPA (안티 펩타이드 항체에 의해 안정 동위 원소 표준 및 캡처)이라고도합니다.이 기법 2 다중 / 선택된 반응 모니터링 질량 분석법에 의해 안정 동위 원소 희석 및 검출과 펩티드의 선호도 강화가 ( SRM / MRM – MS)는 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공합니다. SRM / MRM – MS 잘 작은 분자 3, 4의 정확한 quantitation을 위해 설립되고 최근에는 플라즈마와 세포 lysates의 단백질의 농도를 측정하는 맞게되었습니다. 단백질의 quantitation를 달성하기 위해 5-7이 큰 분자로 소화 같은 트립신과 같은 효소를 사용하여 구성 요소 펩티드. 누구의 순서대로 해당 종의 대상 단백질 (예 : "proteotypic"펩티드)에 독특한 하나 이상 선택 펩티드는 다음 방지 펩티드 항체를 사용하여 샘플에서 농축하여 시료의 단백질 농도에 대한 정량 stoichiometric의 surrogates로 측정됩니다. 따라서, 안정 동위 원소 희석 (SID) 방법 (즉, 아군 인 펩타이드 표준 표시 안정 동위 원소), SRM / MRM 복잡한 생물 학적 매트릭스의 단백질 양을 정함 대한 surrogates로 proteotypic 펩티드의 농도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.을 결합 assays은 전통적인 immunoassays에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 시약은 생성하기 위해 상대적으로 저렴, analyte에 대한 특이성이 우수합니다, assays가 높은 멀티 플렉스 수, 농축은 깔끔한 플라즈마 (더 고갈 필요 없음)에서 수행하고, 기술은 단백질이나 수정의 다양한 의무가있다 할 수있다 자석 구슬 플랫폼에 맞게 본 동영상에 대한 관심. 8-13의 우리는 기본적인 프로토콜을 보여줍니다.
Protocol
Discussion
로 설명한 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 구슬이 부화 기간 동안 잘 혼합 남아 보장합니다. 구슬이 잘 / 유리병의 바닥에 정착 수 있도록하는 것은 다양성을 증가 발생합니다. 또한 중요하기 잠복기 다음 잘 / 유리병의 상단에 남아있을 수있는 액체 다운 스핀. 재현성 트립신의 소화도 중요합니다. 그러나, 그것은 소화의 가능성이 다른 방법이 대상 단백질의 주어진 집합에 대한 최적화할 수 있습니다 무료로 항체의 15 용리가의 검색을 방해하지 않는다;. 소화에 대한 절차는 SISCAPA와 함께 우리의 연구실에 광범위하게 활용되어 여기에서 설명한 항체가 나중에 펩티드보다 열 또는 elutes에서 제외되어 있지만 항체가 이전에 대규모 실험 또는 무료 항체 경우 친화 농축에 단백질 G 비즈에 가교 될 수 있기 때문에 가능성이 펩티드는 문제가된다. 우리는 또한 잔여 구슬이나 입자를 제거하는 예제 autosampler에 접시뿐만 아니라 흐름의 반대 방향으로 트랩 열을 씻는 아래 자석을 (로딩에 비해) 장소에 유용하게 나타났습니다. 설명 마그네틱 비드 접근뿐만 아니라, 기술도 칼럼 형식 (즉, 친화 크로마 토그래피)에 적용할 수 있습니다. 12, 16
사용자가 전체 프로토콜과 함께 편안한되면, 기술은 또한 전체적인 분석을 강화 몇 가지 수정 의무가 있습니다. 우선 11, 그것이 강화 단계 (즉 멀티플렉싱)에 항체를 결합하여 하나의 분석에서 여러 analytes를 분석 할 수 있습니다. 질량 분석계는 동시에 analytes 다수의 분석이 가능합니다. 둘째, 원래의 샘플의 볼륨을 증가하는 것은 분석의 감도를 향상시킵니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NCI 임상 Proteomic 기술 평가 센터 (CPTAC) 부여 (# U24 CA126476)뿐만 아니라 엔터테인먼트 산업 재단 (EIF)과 EIF 여성 암 연구 기금에서 유방암 Biomarker 디스커버리 컨소시엄에 부여로 투자하고,되었다 켁 재단 카나리 재단, 그리고 폴 G. 알렌 가족 재단에서 후한 선물.
Materials
| Name of the material | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific | 97002540 |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 |
| Foil cover for 96 well plate | Excelscientific | 12-169 |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen | 521-01-151 |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific | HSP 9601 |
Table 1: Materials
| Name of the material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Urea | Sigma Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce | 20291 | “no-weigh dithiothreitol” |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific | 28300 | |
| Formic acid | EMD | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 242853 |
Table 2: Reagents
| Solution | Comments (optional) |
|---|---|
| 100 mM Tris pH 8 | |
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
| Stable isotope standard mastermix | |
| Anti-peptide antibody mastermix |
Table 3: Solutions to be prepared
References
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