生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

1。鳥類胚のCAMへの腫瘍の接種 8のようなシェルレス受精ニワトリ胚を準備します。 胚発生の9日目に、1 mLシリンジに接続して18ゲージ針を用いて、マイクロインジェクターを組み立てます。タイゴンチューブの5〜6インチピース（1 / 32"内径、3 / 32"外径、1 / 32"壁厚）をカットし、慎重にチューブに針のベベルを挿入する。チューブの約4〜5インチのはず針の先端（図1a）から延びる。 細胞懸濁液と注射器とチューブを埋める。その後、チューブの端にマイクロインジェクションのガラス針を挿入し、慎重に気泡を取り除く。 CAM（図1c）内ボーラスとして10,000-100,000癌細胞とイルミで解剖の範囲で9日目胚（図1b）を注入する。徐々に細胞を注入し、慎重に針がCAM内に表示されるボーラスを形成する細胞の正しい場所にあることを確認してください。 CAMの表面にドリップをキムワイプまたは他のアプリケーターを用いて洗浄することができる細胞。 60％の湿度で38℃で加湿インキュベーターに胚を戻すと成長し、血管が発達する（最大7日間）に腫瘍ができます。 2。ナノ粒子の調製ニワトリ胚への注入のために蛍光標識CPMVのナノ粒子を準備するには、。いずれかを削除する1分間のために使用し、遠心前にウイルス粒子を（100μg/ mlの濃度に、PBS、pH7.4中8のように合成された渦混合物も希釈凝集体。音波処理も複合体および凝集の程度に応じて役に立つかもしれません。4℃で保存した場合、蛍光標識CP​​MVsの株式は、少なくとも1年間は安定である。·ダークのC。夫婦を入れて定期的に株式をチェックして、スライドガラスの上に落とし、蛍光。透過型電子顕微鏡（TEM）をチェックすると、粒子が抱合した後、そのまま残っているかどうかを判断するために使用することができます。 簡単に言うと、ウイルス粒子の1マイクログラムは、（2μlの最終容量で）銅被覆グリッドに追加することができます。次に、電子顕微鏡（フィリップスEM 410）で1分間、2％酢酸ウラニルの等量を追加します。 3。蛍光標識ウイルス粒子の静脈注射 16日目に、上記のように、マイクロインジェクターを組み立てます。注射器にチューブ（> 200μL）を介してウイルス粒子の所望の体積を描く。慎重に気泡を取り除く。チューブの端にマイクロインジェクション用ガラス針を挿入します。針が（図2a）できるだけ長くしてテーパー状になっていることを確認してください。針が非常に鈍い場合は、外胚葉を通して貫くことができなくなりますし、血管を貫通して失敗します。針が非常にシャープの場合は組織を貫通する際に、先端が収縮されます。 静脈内（図3D）可視化する目的のサイトから遠位の腫瘍を有する胚に1 mg / mlのフルオレセインデキストラン（MW7万ダ、Invitrogen社）の100μlを注入する。 CAMの静脈の成功カニューレは、インジェクションフローのパス内の血液のクリア（図2b）によって明らかである。注入後の血管の漏れ1時間を評価する。 静脈内に目的のサイトから遠位血管の漏れで腫瘍を含む胚には1mg / CPMV -のAlexa Fluor ® 647（CPMV – AF 647）やPEG化CPMV -のAlexa Fluor ® 647（CPMV – PEG – AF 647）mlの溶液50μlを注入する可視化すること。 画像の即座に腫瘍と横河電機回転ディスク、浜松ImagEM 9100〜12 EM – CCDカメラを装着したツァイス審査Z1正立顕微鏡を用いて注射後時間ごと。 4。リアルタイム生体イメージング胚の撮像ユニットを組み立てるには、胚のイメージングユニットの蓋の下側の画像ポートの周囲に真空グリスの薄層を適用し、ポートに18 mmのガラスカバーを装着します。 カバースリップは、イメージングのための必要なエリアをカバーするような胚を配置します。ゆっくりとカバースリップがちょうど胚に接触するまでふたを少し下げて、その後（図2c）の場所でそれを保持するためにユニットの上に蓋をねじ込む。 ° C胚を含む皿の外胚の撮像ユニットに37に加熱水を追加し、その後、37に平衡内部環境室℃で直立共焦点顕微鏡のステージ上に全体のユニットを配置スピニングディスク共焦点蛍光顕微鏡（図2E）の下で胚を含む撮像ユニットを置きます。撮像ユニットは、キャプチャされる三次元Zスタックやタイムラプスイメージの両方を可能にする、場所に胚を保持して画像を取り込む際に固定されたビューのフィールドを保持します。我々は、パーキンエルマーの（旧即興）Volocityのソフトウェアパッケージを（図3a）を用いて3次元タイムラプス画像を取得し、分析する。腫瘍の三次元スタックの高解像度とdetaile可視化するために周囲の血管系を取得する特定の時間点でのD構造解析。腫瘍血管系の詳細な構造変化をマッピングするために定期的な時間の点で三次元スタックを取得する。画像の腫瘍注射後の時間ごと。 腫瘍や間質内の選択した領域内の平均値のAlexa Fluor（AF）647信号（非腫瘍領域）Volocity（パーキンエルマー）等の画像の定量ソフトウェアを用いて計算することにより、ウイルス粒子の取り込みを定量する。間質比は腫瘍は間質の平均AF 647信号を介して腫瘍の平均AF 647信号を割ることにより算出した。 1より高い腫瘍/間質比は、ナノ粒子が腫瘍によって占有されていることを示します。 5。代表的な結果： この例ではここで説明する、私たちは9日目ニワトリ胚（図1b）のCAM内に大きさで1mm程度ボーラスを形成するために、HT – 29結腸癌細胞を注入した。接種後、胚は十分な腫瘍の増殖と血管新生（図1c）を許可する加湿インキュベーターで7日間培養した。胚は、腫瘍の血管新生を確認するために、低分子デキストランを静脈内注射した、と腫瘍はツァイスAxioExaminer Z1正立顕微鏡（図2d）で可視化した。 CPMV – AF 647またはCPMV – PEG – AF 647ナノ粒子（図3aとb）の静脈内投与後、高解像度のリアルタイム共焦点イメージング（図2eは）CPMVとCPMV – PEGは、ナノ粒子の両方が急激に全体の血管系のラベルが付いたことを明らかにしたが、腫瘍によるCPMV – PEGの取り込みは、12時間（図3a）の後CPMVより約3倍高かった。ナノ粒子の相対的な腫瘍の取り込み、画像解析ソフトウェアを（パーキンエルマーからVolocity）を用いて決定した。関心領域は、腫瘍内と外で選ばれた（間質コンパートメントにおける）とそれぞれの平均蛍光強度を測定した。データは、腫瘍/間質比として表現さ​​れます。 図1。鳥類の胚のCAMへの腫瘍のマイクロインジェクション。示されているように（a）にマイクロインジェクション装​​置は、コンポーネントから組み立てられます。 （B）9日目での鳥の胚では、CAMが表面全体を覆​​うように広がっているときに腫瘍を接種する準備が整いました。 （C）16日目では、腫瘍は直径1cm（破線）にまでに成長し、ナノ粒子を注射するための準備ができているでしょう。 図2ナノ粒子の注入と生体内イメージング。 CAMの静脈に注入するインジェクターの針の先端は準備ができて（）を示すと（b）マイクロインジェクターの針が静脈に挿入した（矢印）とクリアで見られる血流（に注入ナノ粒子解剖顕微鏡下で注入血液の）。 CAMとの直接インタフェースカバーと鳥類の胚を含む（C）イメージングユニット。 （D）ナノ粒子の注入に先立って、腫瘍の血管新生は、フルオレセインデキストランの投与後に生体内イメージングを用いて評価する。 （e）のイメージングユニットは37℃に温度調節エンクロージャのセット内で直立共焦点顕微鏡のステージ上に位置する胚を含む 図3。ヒト腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの生体内可視化。腫瘍は、（a）CPMV – AF647と（b）CPMV – PEG – AF647の注入後7時間を可視化している。その後の分析のための鳥類の胚から腫瘍のd）の切除。