Farelerde Cajal (ICC) Ağ İnterstisyel Hücreler Görselleştirme

1. Fare GI kanalda diseksiyonu Yerel IUCAC kurallar tarafından ötenazi farelerde Strafor yüzeyinde her uzuv Pin karın yüzeyi ve% 70 etanol ile yıkayın. Diyafram pubis uzun orta hat kesi ile karın boşluğuna açın. Bir distal kalın bağırsağın distal özefagus ve ikinci bir kesme kesme ve blok tr mide anüs gastrointestinal sistem kaldırmak, küçük bir makas kullanarak duodenum ve çekum dikkatlice ligamentler kesme olun. PBS ile bir petri kabına yerleştirin GI sistem. Cımbız (Şekil 1) kullanarak mezenter parçalara ayır. Mide, ince bağırsak, kalın bağırsak, pyloru ve ileoçekal bileşke kesme ayırmak için. Her bir parçası bir beslenme iğne (eski fareler) veya künt bir iğne (genç fareler) bağlı bir 5ml şırınga kullanarak PBS ile gastrointestinal sistem lümeni durulayın. Mezenterik sınırı boyunca aç mide, ince bağırsak ve kalın bağırsak. GI yolu her bölümü için, tüm montaj görünüm için tek ve cryosection için bir iki parça kesin. 2. Tüm montaj numune hazırlama ve immün GI kanalda her bir parçası, 4 en az 1 saat için 1.0 ml buz gibi aseton ve düzeltme örnekleri ile dolu bir 1,5 cm mikrofuge'de tüp ° C tüm parça yerleştirin. Numuneler -20 ° C'de 1 hafta kadar saklanabilir Biz genellikle aseton örnekleri saklamak ve cyrosections hazırlamak geçin. PBS ile örnek 2X yıkayın. PBS ile petri kabına yerleştirin örneği. Miscroscope diseksiyon altında muskularis bırakarak, bir cımbız ile bir ucunu tutarak dikkatle mukoza tabakası bir neşter ile kazıyın. Kas farklı antikorlar ile boyanarak 5mm parçalar halinde kesilebilir. Boyama önce PBS içinde 2 günden fazla saklamayın. Blok ve inkübasyon adımları iyi bir 24 plaka veya bir 1.5ml mikrofuge'de tüp yapılabilir. Engelleme tampon 0.5 ml (% 5 keçi serumu,% 0,1 Triton az 1 saat 4 PBS X-100 ° C) Blok. Tampon engelleme seyreltilmiş primer antikor ile inkübe ve 4 gece döndürmek ° C Biz anti-Kiti ACK-2 sıçan, tavşan anti-Ano1 ve tüm montaj immün tavşan anti-Pgp9.5 antikorlar başarıyla kullanmıştır. PBS ile 5 dk 2X için oda sıcaklığında rotator yıkayın. Rotator oda sıcaklığında 2 saat süreyle bloke tampon seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin. Biz genellikle Alexa Fluor 488 anti-tavşan ve Alexa Fluor 594 anti-fare antikorları kullanın. Oda sıcaklığında rotator 3X PBS ile 15 dakika yıkayınız. Mikroskopi sırasında doku yönlendirmesini sağlamak için üst slayt, serozal tarafında monte edin. Bu yönelim, lamel yüz ve bir mikroskop, slayt içine odaklanır gibi ilk karşılaşılan serozal tarafında sağlayacaktır. Biz bunu bir diseksiyon mikroskobu. Bazen, kısaca düzgün şark floresan mikroskobu altında dokuyu inceler. Kit veya Ano1 görselleştirmek için floresan mikroskobu altında, bir lamel yan ilk ICC-MY ağ karşılaşmazsınız. Sonra, aspirat PBS mümkün olduğunca olmadan tamamen kurutulması. Sabit montaj seti medya (Altın Prolong kullandığınız) 50 ul ekleyin ve doku üstüne kapak kayma yavaşça yerleştirin. -80 Gece boyunca oda sıcaklığında ve mağaza slaytlar montaj ver ayarı ° C Mikroskobik inceleme için, Z-sürücü ile geniş bir alan mikroskobu kullanıldı. Biz ya 20X hava bir objektif (NA 0.75, planı apochromat) veya 60X yağlı objektif (NA 1.4, planı apochromat) ve 2 mm veya tüm muskularis yayılan Z kesitler 1 mikron aldı. Görüntüler daha sonra AutoQUANT deconvolution yazılımı kullanarak deconvoluted. Alternatif olarak, diğerleri benzer sonuçlar yerine konfokal mikroskobi kullandık. 3. Cryosection hazırlanması ve immün Filtre kağıdı düz aşağı GI yolu, serozal tarafında, her bir parçası yerleştirin. Doku çevresindeki filtre kağıdı kesin. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS (% 32 kullanmadan önce doğru PBS içine kapalı flakon paraformaldehid sulandırmak)% 4 paraformaldehid (PFA) filtre kağıdı üzerine koyun doku. Veya doku büyüklüğüne bağlı olarak 12 plaka, 1.5 ml mikrofuge'de tüp Fixation 6 yapılabilir yapabilirsiniz. Plakasını yapılırsa, parafilm PFA maruziyeti en aza indirmek için. Daha uzun fiksasyon kez, özellikle de anti-Kiti ACK-2 antikor, antijen maskeleme neden olabilir. PBS içinde% 30 sakaroz PFA doku ve yer çıkarın. İzin doku 4 gece lavaboya ° C 1 saat süreyle% 30 sükroz ve OCT 1:1 oranında doku dengelenmesi. Sonra GI sistem boylamasına ekseni cyrosections paralel olmalıdır OCT ile dolu cryomold dikey doku monte edin. Farklı genotipleri ile veya farklı tedaviler ile fareler incelendiğinde, paralel işlem sağlamak için aynı cryomold üzerine farklı farelerde doku monte etmek için yararlı olabilir. Kuru buz ve yer saklama için -80 ° C derin dondurucuda dondurun. 10 mikron cryosections Kes-80 ° C derin dondurucu slayt ve mağaza üzerine. Biz genellikle iki bölümden slayt başına kesti. Ayrıca genellikle bir cryosection slayt H & E boyama gerçekleştirin. Immünofloresan için, ilk 15 dakika boyunca oda sıcaklığında slayt dengelenmesi. Sonra PAP kalem kullanarak doku etrafında bir daire çizin. 1 saat süreyle bloke tampon (bütün monte immün aynı) 150 ul engelleyin. Aspire engelleme tampon ve tampon engelleme seyreltilmiş 150 ul primer antikor ekleyin ve 4 gece inkübe ° C nemlendirilmiş bir odasında. PBS ile 5 dk 2X yıkayın. Oda sıcaklığında 2 saat tampon engelleme seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin. Biz genellikle Alexa 488 anti-tavşan ve Alexa 594 anti-fare antikorları kullanın. 3X PBS ile 15 dakika süreyle yıkayın. Doku tamamen kuruyan olmadan slayt aspire. DAPI (Altın Prolong kullandığınız) # 1.5 lamel ile medya montaj sert kümesinin bir damla ekleyin. Gecelik oda sıcaklığı -80 ° C derin dondurucuda kurulum ve saklama yeri slayt. DAPI, FITC, ve Texas Red filtre setleri kullanılarak üçlü floresan görüntüler elde. 4. Temsilcisi Sonuçlar: Burada, biz, bir örnek olarak kalın bağırsak kullanır. H & E sukroz leke immünofloresan için kullanılan dondurulmuş bölümünde sabit korunan bazı eserler bir referans parafin bölüm (Şekil 2), gösterir nerede dairesel ve uzunlamasına kas tabakaları ve yeşil hat demarks arasında sarı çizginin demarks myenterik pleksus arasındaki sınır mukoza ve muscularlis. Seroza mukoza cryosection incelenmesi, ilk olarak kalın yuvarlak kas (CM) tabakası tarafından takip uzunlamasına ince kas (LM) katmanı karşılaşıyoruz. CM çekirdeklerin, küçük ve yuvarlak olmalıdır LM çekirdekleri biraz uzun olmalı, böylece bölüm uzunlamasına kas ile paralel olmalıdır. LM ve CM arasında Pgp9.5 ile leke nöronlar yapılan myenterik pleksi. CM boyunca Pgp9.5 lekeleri nöronal süreçleri. Myenterik ICC ağ (ICC-MY) myenterik pleksus çevreleyen ve çok kutuplu hücreler yapılır. Longitudinal kas tabakasının içinde, bipolar hücreleri kas ile paralel olarak çalışan nadir intramüsküler ICCS (ICC-IM) vardır. Sirküler kas tabakası içinde de dairesel bir kas ile paralel ve bu kesim kesitli bipolar hücreleri olan ICC-IMs bol vardır. ICC-TPF oluşan submukozal ICC ağ muskularis ve submukoza kavşağında, düz, çok kutuplu ICCS bir ağdır. Lamel odaklanır gibi kalın bağırsak immün bütün montaj Kiti incelenmesi, bir (Figure. 3), CM ICC-IM ve ICC-SMP ağları sonra ICC-MY ağ ilk karşılaşmaya bekliyoruz. . Tüm montaj görüntüler 3 boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak ICC ağları Volumetrik ölçüsü 10 tarif edilmiştir. Geniş alan mikroskobu kullanarak, önemli bir düzlem-dışı floresan deconvolution sonra kaldırılır (Şekil 3) ham görüntüleri var. Mukoza sıyırma Eksik yüksek eşiğe neden olacaktır. ANO1 başka bir ICC'nin marker ve co-immün KİT ve ANO1 ICC boyama (Şekil 4) tam bir örtüşme gösterir. Şekil 1. Temsilcisi izni 13 ile yeniden basıldı, fare gastrointestinal sistem disseke. Şekil 2 A) Temsilcisi H & E boyama cryosections bazı büzülme eserler gösteren bölümünde anlatıldığı ve referans parafin hazırlanmış cryosections fare kalın bağırsak. Sarı hat demarks myenterik pleksus ve mavi çizgi, muskularis mukoza ayırır. B) Temsilcisi Kit (kırmızı, ACK-2) ve Pgp9.5 (yeşil) fare kalın bağırsak DAPI (mavi) counterstaining ile çift immünofloresan. LM: uzunlamasına kas CM: dairesel kas. Ölçek çubuğu 20 mm. Şekil 3 Temsilci Kiti (kırmızı, ACK-2) tüm montaj üç odak düzlemleri aynı alanda immünofloresan, ICC-MY LM / CM sınırında uçak, CM ICC-IM uçak ve ICC- CM / submukozaya sınırda SMP düzlemi. Ham görüntüleri ve deconvoluted görüntüleri gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 20 mm. Şekil 4 Ano1 (yeşil) ve kalın bağırsak Kiti (kırmızı, ACK-2) Temsilcisi çift immünofloresan. Ölçek çubuğu 20 mm.