ויזואליזציה של תאים ביניים של רשת (ICC) קחאל ב עכברים
Summary
התאים ביניים של קחאל (ICC) הם תאים של מערכת קוצב לב (GI) במערכת העיכול. הם יוצרים רשתות מורכבות בין לתאי שריר חלק ופוסט ganglionic סיבים עצביים להסדיר contractility העיכול. כאן, אנו מציגים שיטות immunofluorescence חתך שלם הר ויזואליזציה של Murine רשתות ICC.
Abstract
התאים ביניים של קחאל (ICC) הם mesenchymal נגזר "תאים קוצב לב" בדרכי (GI) במערכת העיכול שיוצרים גלים איטיים ספונטנית נדרש תנועה פריסטלטית לתווך קלט עצבי מ system1 העצבים enteric. תת שונים של ICC טופס רשתות נפרדות muscularis של מערכת העיכול 2,3. אובדן או פציעה של רשתות אלה קשורה עם מספר רב של הפרעות תנועתיות 4. תאים ICC לבטא את הקולטן KIT טירוזין קינאז על הממברנה פלזמה KIT immunostaining שימש במשך 15 השנים האחרונות לתווית רשת ICC 5,6. חשוב לציין, הפעילות KIT נורמלי נדרש ICC פיתוח 5,6. שינוי Neoplastic של ICC תוצאות תאים סרטניים סטרומה העיכול (GIST), כי לעתים קרובות הנמל רווח של פונקציה מוטציות KIT 7,8. אנחנו לאחרונה הראה כי ETV1 הוא גורם השושלת הישרדות ספציפית לידי ביטוי בשושלת ICC / GIST והוא רגולטור תעתיק הנדרש להיווצרות הן ICC נורמלי עבור רשת של tumorigenesis GIST 9. בנוסף, אנו להוכיח שהיא משתפת פעולה עם הפעלת מוטציות KIT ב tumorigenesis. כאן אנו מתארים שיטות הדמיה של רשתות ICC בעכברים, המבוססת בעיקרה על הפרוטוקולים שפורסמו בעבר 10,11. לאחרונה, ערוץ כלוריד anoctamin 1 (ANO1) יש גם מאופיין כסמן קרום מסוים של ICC 11,12. בגלל לוקליזציה שלהן פלזמה הממברנה, immunofluorescence של חלבונים גם יכול לשמש כדי להמחיש את רשתות ICC. כאן אנו מתארים להדמיה של רשתות ICC ידי קבועה קפוא cyrosections וההכנות הר שלם.
Protocol
Discussion
תאים ביניים של קחאל התאפיינו תחילה על ידי סנטיאגו Ramóón אי חז'אל בדיוק לפני מאה שנה באמצעות כחול וכסף מתילן כרומטי כתמי muscularis העיכול. קחאל בהתחלה חשבתי ICC היו של נוירונים המבוססת על התהליכים שלהם המזכירים אקסונים דנדריטים. במהלך השנים שלאחר מכן רבים, המחקר של בית הדין הפלילי הבינלאומי ביולוגיה הוגבל על ידי חוסר סמנים ספציפיים עד גילוי KIT כי לא רק מתבטא ICC, אך נדרש גם עבור הפיתוח שלהם 6. מאז, KIT immunofluorescence כבר בשימוש נרחב במחקר של ICC ביולוגיה הובילה גם הערכה של ICC באיברים אחרים כגון התכווצות שלפוחית השתן. לאחרונה, ANO1 זוהה הסמן השני ICC אמין.
היו פרסומים רבים על פני 15 השנים האחרונות באמצעות immunofluorescence לזהות ICC באמצעות קיבוע שונים וטכניקות הרכבה. בידיים שלנו "קבוע קפוא" cryosections כי כבר ולפניה paraformaldehyde ו סוכרוז מוגן עובד בהשוואה הטובה ביותר אצטון או paraformaldehyde שלאחר קיבוע לאחר cryosectioning. עבור mounts כולו, מצאנו כי הקיבעון אצטון ואחריו לנתיחה הרירית נותן את התוצאות הכי חזקים.
מבחינה היסטורית, ACK-2 כבר את ערכת נוגדן הבחירה של העכבר ICC זיהוי. זוהי חולדה חד שבטיים המכירה תחום תאי וזה גם נוגדן חסימת שגורם ileus כאשר נתון לחיות עכברים. עם זאת, epitope ACK-2 הוא נהרס לאט על ידי קיבוע paraformaldehyde ואינו חולץ על ידי שיטות אחזור תקן אנטיגן. מצאנו כי epitope ACK-4 עמיד יותר קיבעון paraformaldehyde. לעומת בלוקים קפואים סעיפים קבועים, בלוקים פרפין מוטבע וחתכים משמר מורפולוגיה טוב יותר הוא נוח יותר לטווח ארוך אחסון (איור 4). לא ACK-2 ולא ACK-4 שימשו בהצלחה בסעיפים פרפין. יש לנו מאופיין כי D13A2, נוגדן חד שבטי ארנב חדש, עובד מצוין בשני חלקים קבועה קפוא פרפין של מערכת העיכול.
ערכת מתבטא בכמה סוגי תאים אחרים, ובהם המלנוציטים, תאים hematopoietic, בתאי הנבט, וכן תא הפיטום מסוים אשר נמצאים גם במערכת העיכול. למרבה המזל, תא הפיטום ביותר נמצאים היא רירית ולא muscularis. צביעה כפולה עם ארנבת אנטי Ano1 ואת עכברוש אנטי ערכת יכולים לחסל הלא ספציפית של נוגדן כל מכתים (איור 4). זה גם ראוי לציין כי את הביטוי היחסי של קיט Ano1 בין subclasses של ICC נראה שונה. לדוגמה, במעי הדק, מכתים קיט היא הרבה יותר אינטנסיבי בכאל myenteric לעומת ICC של השריר מקלעת עמוק בעוד Ano1 מכתים דומה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן (K08CA140946, כדי י"ס), (5F32CA130372, למחשב), (ו R01CA102774 R01HL055748 על PB), משרד הביטחון (PC094302 אל י"ס), קרן משפחת שומן למחקר GIST (ל PC), לבין קונסורציום סרטן סטאר (למחשב, י"ס, CLS ו PB). ברצוננו להודות קטיה Manova, מניפה נינג, ו Mesurh Turkekul של מתקן הגרעין MSKCC מולקולרית ציטולוגיה לעזרה עם cryosectioning ו immunostaining.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
| rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
| rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
| rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
| Animal Feeding Needle | Fisher | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
| Blunt Needle | Becton Dickison | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
| Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | EM Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
| Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |
References
- Sanders, K. M. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).
- Ward, S. M., Sanders, K. M. Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).
- Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. J Physiol. 576, 653-658 (2006).
- Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. Development and plasticity of interstitial cells of Cajal. Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).
- Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. J Physiol. 480, 91-97 (1994).
- Huizinga, J. D. W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, 347-349 (1995).
- Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet. 369, 1731-1741 (2007).
- Hirota, S. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science. 279, 577-580 (1998).
- Chi, P. ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST). Nature. , (2010).
- Kwon, J. G. Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors. Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).
- Hwang, S. J. Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles. J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).
- Gomez-Pinilla, P. J. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).
- Sommer, G. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).
