高分子 - リガンド親和性を測定するための等温滴定カロリメトリー

等温滴定熱量測定（ITC）は、1回の実験で結合相互作用のすべての熱力学的パラメータ（親和性、エンタルピーと化学量論）を決定することができます1。ITCの作品は、等温条件下での第二の反応に1つの反応物質を滴定することによって確立された手法です。測定された信号は、2つの反応物の相互作用により放出または吸収された熱（バインディング）です。注射のシリーズが行われ、制限反応が飽和状態になると熱信号がゼロに近づきます。等温線のフィッティングは、熱力学的パラメータを与える。いくつかのレビューは、計測だけでなく、データの収集と分析の数学を記述することが可能です。2,3他の熱量計が利用可能であるが（特に小さなボリュームを持つITC 200）、ここではVP – ITCのための一般的なプロトコルを製造説明MicroCalで（現在はGEヘルスケアの一部）。 1。準備サンプルバッファ内高分子とリガンドを準備するためには、いくつかの潜在的な問題に対処する必要があります。正確なフィットは、巨大分子の適切な濃度は、通常はサンプルのITCのセル、および配位子になる種、注射器で種を必要とする。いくつかのタンパク質が注射器の種のために必要な高濃度で集約しているため、ほとんどの場合、タンパク質は、試料セルにロードされます。最適な高分子の濃度は、"C"、前のITCを使用する直交の方法を用いて推定することができるシステムの予測親和性、の製品、および合計高分子の濃度から決定されますここで、c = K A * [M]。 10から1000まで、1からCの範囲の最適値が下限値以下のC -値を持つ特定の実験条件下で弱結合システムのための正確なデータを得ることは可能ですが。従って4は 、高分子濃度がこの範囲のを決定しなければならない心の中のcの値（すなわち、Kが10 6 M -1の、10〜1000μmの高分子濃度を使用する必要があります）。システムの結合親和性の事前の知識は、ITCの実験の優れたデザインを通じて、ITCのために使用される蛋白質を最小限に抑えることができます。その彩度は滴定の半分に最初のサード内で行われるように、リガンドの濃度は、（最も弱いリガンド結合部位のK dよりも濃縮された7月25日倍）に十分な大きさでなければなりません。データの正確なフィッティングも、信号の飽和が必要です。高い結合親和性を持つシステムでは、低配位子の濃度が不正確な近似を与えることとなる、早すぎる滴定の飽和を回避するために使用する必要があります。希釈制御の熱（バッファへのリガンドのすなわち滴定）は​​滴定から減算されると、飽和時のエンタルピーはゼロに近づくはず。 小分子の不純物は、ITC測定の人為的な信号を生じさせることができるので、高分子とリガンドの網羅的緩衝液に対して透析することを、可能であれば、最高です。また、カラムクロマトグラフィーは、スピンカラム、またはバッファー交換を脱塩、遠心フィルター（例えば、Centricons）は高分子のバッファを変更することができます。リガンドは、小分子である場合、それは高分子が（スペクトラ/ポアフロート- A – Lyzerのためのすなわち100から500打の小さな分子に適したカットオフの透析膜に対して透析によって透析された後、または透析緩衝液を用いて調製することができる）。リガンドと高分子ソリューション間の緩衝液組成の違いは、サンプル中の不純物の希釈熱からアーティファクトを通知する可能性があります。調製後、エンタルピーのアーティファクトとしてバッファ、高分子とリガンドの一致（± 0.05 pH単位）のpHは、プロトン化の効果をバッファリングするために発生する可能性がある確認してください。5は十分にそれぞれの種のを準備することを確認してください。三連の実験および希釈制御のために、必要な材料の量は、使用ITCに依存する。しかし、おおよその2mlの体積の試料セルを持っているほとんどのITCの楽器のために、高分子溶液の少なくとも6〜7ミリリットルが必要になるだろう、と便利な15ミリリットルファルコンチューブに調製することができる。 300μL注入シリンジの場合は、解決策の1〜2 mlは十分なはずです、とファルコンチューブまたはマイクロチューブのどちらかで調製する​​ことができる。 ほこり、およびその他の微粒子は、ITCのサーモグラムのベースラインでアーティファクトが発生する可能性があります。それは、彼らが実験を実行する前に削除されることが不可欠です。サンプルのストック溶液の調製後、サンプルは溶液中でペレットの粒子から8000まで14,000 rpmで5分間マイクロ遠心チューブで遠心分離する必要があります。ペレットを乱さない、そして新たなファルコン/マイクロ遠心チューブに配置しないように注意しながら、上清を取り除きます。 還元剤が減少したシステインを維持するために必要な場合は、β-メルカの低濃度と新鮮な在庫を使用してくださいptoethanol、TCEP（トリス（2 – カルボキシル）ホスフィン）または還元剤の酸化に起因するいかなるアーティファクトを最小限に抑えるためにジチオスレイトール。また、バッ​​ファ中の有機溶剤の存在は（水溶性であるためにはメタノールやDMSOが必要となる可能性がある小分子リガンドのための一般的な）信号のアーチファクトを引き起こす可能性があります。有機溶剤は、配位子のために必要な場合には、高分子溶液はまた、有機溶剤の希釈熱から生じる任意の信号を避けるために、同じ濃度に含まれている必要があります。共溶媒、塩類やpHによるリガンドと高分子との間の緩衝液組成のわずかな違いは、サンプルの調製中に可能です。バッファの内容の違いから生じる熱の信号は、アーチファクトのみから生じるデータを発生させないことを保証するために高分子にサンプルバッファーやサンプルバッファーにリガンドの希釈をチェックするのが最善です。 慎重にそれらの正確な濃度を記録するために、システムに適切な技法（例えば吸光度測定、HPLC、比色アッセイ、タンパク質のBCAアッセイ、などなど）を使用して、高分子とリガンドの濃度を確認してください。実際の濃度と等温線を合わせて使用​​される濃度の違いは、実験から決定された化学量論、エンタルピーと結合親和性でエラーが発生します。それはサンプルが特に高い温度で、気泡や滴定中の溶存ガスの放出に起因する信号のアーチファクトを避けるために、脱気するのが一般的です。 2。実験のセットアップサンプルセルと注射器は、高分子とリガンドをロードする前に、製造元のプロトコールに従って洗浄されていることを確認します。ハミルトンシリンジを（バレルが簡単に壊れているようにハミルトンシリンジまたは針を曲げてケアを使用）を使用して蒸留水1.8 mlの試料セルを2,3回すすいでください。次のバッファの1.8 mlの試料セルを数回すすいでください。気泡の形成を避けるために注意しながら、高分子溶液を1.8ミリリットルを試料セルをロードします。 蒸留水で参照セルを埋める。ほとんどのバッファでは、蒸留水は、標準溶液として使用するのは良いことです。しかし、特に高イオン強度や浸透圧を持つバッファのために、それは参照としてバッファを使用することをお勧めします。 ハミルトンシリンジを使用してリファレンスとサンプルの細胞から気泡を取り除く。ゆっくりと、セルの下部になると、セルの上部によくに接続されている可能性のある泡をノックセルの両側上下シリンジの針を動かす。サンプルとリファレンスの細胞から余分なボリュームを削除します。 チューブを使用して、注射器の充填ポートにプラスチック製の注射器を取り付けます。蒸留水と注射器を洗浄します。バッファリンスで従ってください。注射器が完全にシステムを介して空気を描画することによって真空排気されていることを確認します。リガンド溶液に注射器の針を置き、全体の注射器がいっぱいになるまで注射器にリガンド溶液を描く。ポートと接続​​されたチューブに少し余分なボリュームを（約50μl以上）描き続ける。すぐにシリンジの充填ポートを閉じて、チューブとプラスチックシリンジを切り離します。パージと詰め替え注射器シリンジから気泡を除去するためにさらに2回。リガンド溶液からシリンジを取り外し、これは注射器からボリュームを削除する可能性があるため、キムワイプにシリンジの先端を触れないように注意して、任意の水滴を除去するキムワイプが付いている面を拭いてください。また、これはまた、注射器の先端からのボリュームの損失を引き起こす可能性があるとして、注射器をノックやjarにしないように注意してください。サンプルセルへの注入の注射器を置きます。 ITCを実行するためのパラメータを設定します。強力な熱信号との結合システムでは、低容量注入の多数は、フィッティングのためのより多くのデータポイント（3μlの例75注射）を与えます。弱い熱信号を持っているシステムでは、大容量注入の数が少ない（8μLの例33注射）が好ましい。最も一般的に、より高い注入量と少ない注射が使用されています。それはあなたのシステムに最も適した条件を最適化するためにいくつかの滴定がかかる場合があります。結合エンタルピーはどちらか検討しているシステムに応じて、発熱または吸熱することができることに注意することは重要です。残念ながら、いくつかのシステムが決定するために反応熱が難しく、低熱信号を持っている。このようなシステムの問題が潜在的に（結合系の熱容量に応じて）実験の温度を変える、高分子の濃度を増加させる、および/またはpHや緩衝液のイオン強度を変化させることによって克服することができます。 また、各注入の間の時間間隔を考慮してください。それは、リガンドの各注射後、システムが平衡状態に時間を与えていることが不可欠であり、次の注入が発生する前に熱の信号がベースラインに戻ります。ほとんどのシステムでは、3〜5マイルnutesは十分なはずです。注射の間の時間は平衡が5分以内に発生しないシステムを大きくする必要があります。 それは、サンプルセルに挿入されると、注射器の高分子とリガンドのソリューションの間にいくつかの混合が作成されるため、最初の注射は、誤った結果が得られます。最初の1〜2回の注射のために少量（例えば、2μl）を使用する（したがってこれは、後で破棄することができる）とを所望の値で、その後の注射を維持するのが最善です。 実験の温度を選択してください（25℃、最も一般的なもので、2と80の間の温度° Cを使用することもできます）。リガンド – 高分子システムで実行される他の実験を（結合、反応速度、など）に一致する温度を選択することが最善です。 ITCは、実験の温度と異なる温度で平衡するように設定することができます。実験は、10以上の温度で行うことを予定している場合° C離れて室温から、それは5内に楽器のための平衡温度を設定することが最善です·実験温度のC。これにより、機器は実験の温度に到達するのに要する時間が短縮されます。 注射器の攪拌速度も考慮する必要があります。攪拌は、滴定中のリガンドと高分子の十分な混合のために必要ですが、いくつかのタンパク質が急速に攪拌することによって不安定化されています。これらのケースの場合は、攪拌速度は、比較的低い速度で設定する必要があります。一度にすべての実験パラメータは、実験を開始することができる、設置されている。 実験が終了すると、ITCは、製造元のプロトコールに従って洗浄することができます。高分子 – リガンド複合体混合物についての追加実験が望まれる場合、実験の終了時に試料セル内の溶液を保持することができます。 滴定の再現性のあるデータを得るために少なくとも1つまたは2つ以上の回を繰り返します。配位子が配位子のために希釈熱を決定するために試料セル内のバッファに滴定する制御を実行します。バインディングプロセスについての協同的結合、追加情報があるいくつかのシステムでは配位子に高分子を注入することによって得ることができる。別の射出方向は、グローバルなフィッティングのために役立つと思われる追加情報を、与えることができます。6 3。データの分析データのフィッティングを容易に任意のデータフィッティングプログラム（通常は楽器と一緒に製造元から提供される）でマクロを使用して実行することができます。最初のデータファイルを読み込みます。信号の気泡や他のアーティファクトの兆候がない生のサーモグラムを確認してください。いずれかのアーティファクトが（たとえば、その時点では注射がなかったベースラインやピークのスパイクなど）がある場合、それらを削除する必要があるとして、その後これらのデータの点に注意してください。次に、リガンドの希釈の制御データをロードし、結合等温線からのリガンドの希釈のデータを引く。この時点で、希釈アーチファクトが発生する滴定の最初の1つまたは2つのデータポイント（手順7を参照）を含め、すべてのスプリアスのデータポイントを削除します。 データに合わせて使用​​されるデータフィッティングモデル（一つの結合部位、二つ/複数の結合部位を、協同的結合など）を選択します。データは、（K）フィッティングパラメータ、化学量論（N）、エンタルピー（ΔH）との結合親和性の初期推定値と適合することができます。結合親和性、またはその他のパラメータの事前の知識は、直交実験から知られている場合、これらの値を入力できます。これは、フィッティング中に極小値にトラップさになるフィット感を避けることができます。データが最初に滴定に合わせしたら、等温線の残りのために、手順15〜16を繰り返します。また、データは、SEDPHATなどのプログラムを使用してグローバルに適合することができます。6 SEDPHATは、三元の複雑なデータセットとの組み合わせでバイナリ複雑なデータセット（すなわち分子A + B）のグローバルフィッティングで特に役立つと思われる（分子A + B + C）。例えば、AB複合体への分子のCの結合で、それは（完全に飽和されていない場合）、またはBのためにCの結合に起因するいかなる信号が存在する可能性があるかどうかは必ずしも明確ではない。 ITCのデータは、人工ではないことを確認するには、結合親和性とITCから得られる化学量論は、直交する方法と比較する必要があります。さらに7,8、ITCのエンタルピーの値はvan't Hoffのプロットからエンタルピーに比較することができます。9また、熱の信号の絶対値が増加して高分子濃度とともに増加するはずであるとして、リガンドまたは高分子の異なる濃度を使用するために役立つことができます。アーティファクトは、細胞と注射器内のバッファが一致していない場合に発生する可能性が高いです。アーティファクトの別の可能性としては不純サンプルから生じる。 我々は、K dとstoichで利用可能な以前の情報があるため、ユーザーは単純なバイナリ複雑な滴定を開始することをお勧めしますiometry。その後、追加のリガンドが結合する場合、ユーザーは、リガンドの濃度を変化させる、より複雑な三元複合体の滴定を試すことができます、そして、おそらく注射器や細胞成分を切り替え。エンタルピーは状態関数であるとして、三元複合体形成への両方のパスのためのエンタルピーを比較すると、添加物でなければなりません。アゲイン10、SEDPHAT 6はここに非常に有用である可能性が高いです。 4。代表的な結果： 図1 E.の補因子NADPHの結合のための行儀の滴定の代表的な例大腸菌染色体のジヒドロ葉酸還元酵素（ecDHFR）。 Originソフトウェアの1つのサイトモデルを使用して統合されたサーモフィットから、（B）の結合等温線を;パネルは、（）生のサーモグラムを示し、（C）等温線のフィットに沿ってSEDPHATから一結合部位のモデルを使用してフィット残差を持つ。 Originソフトウェアから、一つのサイトバインディングモデルを使用して、N = 1.09 ± 0.02、K D = 0.194 ± 0.001μM、ΔH= -22.7 ± 0.4 kcal / molの、TΔS= -13.1 ± 0.4 kcal / molの、とΔG= – 9.16 ± 0.01 kcal / molの。 Sedphatが0.94のn個を余裕が使用してデータのフィット± 0.01、0.195のK dは± 0.013ΔM、-22.5のΔH± 0.2 kcal / molの、-13.39のTΔSkcal / molとし、-9.15 kcal / molののΔGが。