一种无创性的发采样技术，以获得难以捉摸的小型兽类高质量的DNA

1。发圈套在此之前设立一个圈套，一个理想的位置已确定将在鼠兔栖息地或距骨斜坡。这包括干草桩，这是植被缓存动物在夏末，以及在厕所站点发现的新鲜粪便收集。打包带（长度10 – 50CM）​​条卷起提供了360 °粘表面，并在信封鼠的干草桩（图1）或厕所网站入口处的一个类似Web的方式安排。根据岩石的配置上，一块鱼线可用于支持头发的圈套结构，但这往往是没有必要时，入口非常小（直径30厘米），使用的完整描述鱼线，可以发现在亨利和罗素（2010）3。发网罗尽可能经常检查和头发样品存放在磁带上（图2），然后收集和标记。一旦运回实验室，毛发从粘用无菌镊子的磁带，并转移到低温管，并储存在-20 ° C，直到进一步的处理。集群沿着头发圈套在一起的头发样本被认为是属于一个单一的个体，而集群独立样本被假定为属于不同的个人。在后一种情况下，头发，然后放置在不同的管。这些假设可以在以后测试微基因型数据为基础的DNA指纹图谱和身份的概率计算方法。 2。 DNA的提取由于鼠的头发是非常薄的，并包含一个微小的根灯泡，我们先前已经表明，至少25根头发都需要获得足够量的DNA质量好下游PCR 扩增 3 。我们使用DNA IQ系统（Promega公司，麦迪逊，威斯康星州，美国）和一个稍作修改的版本头发样本进行DNA隔离制造商的指示。首先，在一个微型离心机旋转的头发样本，为了避免脱发，同时开放管。然后孵化的解决方案是准备加入10μl的DTT（1M）和蛋白酶K（18ng/ml）加入10μl混合80μl孵育液的结果在终浓度为0.1米DTT和蛋白酶K孵化1.8ng/ml溶液（100微升）加入样品，并在56 ° C下孵育1小时。在此期间，裂解液准备为每100μL裂解液加入1μL的数码地面电视（1M），导致在最后一个0.01M的DTT浓度。准备裂解液（200μL），然后向样品中加入，7μL的DNA IQ树脂，3秒高速振荡，室温下孵育5分钟。该样本是2秒，然后振荡在磁场的立场，从溶液中分离磁珠时插入。余下的解决方案，然后吸气和丢弃，小心不要去打扰磁性树脂颗粒。样本，然后用100μL的准备裂解液，振荡并返回到磁隔离再次发生的立场。裂解液吸气和丢弃，这一步是使用洗涤缓冲液（100μL）重复三次。样本随后离开干在15分钟的磁场立场。干燥后，100μL洗脱缓冲液加入样品，并在65℃5分钟孵育。该样本是振荡并插入磁立场。该解决方案现在包含洗脱DNA，然后转移到1.5 mL Eppendorf管，在-20 ° C保存，直到进一步的操作。肝脏样本中的DNA提取DNA IQ系统和使用作为阳性对照PCR扩增。 3。 PCR扩增从我们的非侵入性的头发圈套和肝脏样本中获得的DNA，然后用放大了一套常用的分子标记（微卫星，AFLP，线粒体细胞色素b和ZFX / ZFY绝育标记）。 PCR产物均用一个Veriti热循环仪（美国应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚，美国）在25μL的体积，内含：10 – 20纳克的DNA，引物各0.5微米，10毫米的Tris – HCl（pH值8.3），50毫米1.5毫米氯化钾，氯化镁2，200μMdNTPs，10μ牛血清白蛋白（BSA的; NEB公司，伊普斯维奇，马萨诸塞州，美国）和0.5 U AmpliTaq黄金DNA聚合酶（Applied Biosystems公司）。骑自行车的微卫星位点的参数进行了优化，使用触地循环程序（10分钟95℃，35周期在95 ° C，30秒30秒退火，和45小号72 ° C，在72的最后一步° C下10分钟）。退火温度降低1 ° C，每个周期从60到55℃直至达到第六个周期，在这一点其余的29个周期持续在55 ° C。线粒体片段的循环参数如上所述，但包括35个循环与退火温度50 ° C。扩增片段长度多态性进行了以下的小笠原4所描述的脊椎动物基因组的协议。最后，分子进行性别鉴定是使用HinfI酶切5 ZFX / ZFY位点的PCR – RFLP 。从微，AFLPs和细胞色素b基因序列的PCR产物到ABI 3130xl基因分析仪（美国应用生物系统公司），而消化ZFX / ZFX片段100 bp的阶梯上含有3％的琼脂糖凝胶（New England Biolabs公司）一起运行2.5％的SYBR安全DNA凝胶染色（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州）和可视化，使用的是Red的个人凝胶成像系统（阿尔法INNOTECH公司，美国加利福尼亚州圣莱昂纳多）。微和AFLPs可视化使用GeneMapper v3.7（Applied Biosystems公司）和线粒体DNA色谱使用Sequencher V4.7（基因代码公司，安港，心肌梗死，美国）的可视化。 4。代表性的成果从获得使用我们的非侵入性的圈套的头发样本中提取的DNA用于PCR扩增不同类型的分子标记。作为比较的基础上，DNA提取使用，与我们的头发样本扩增肝脏样本。核微卫星位点，成功地扩增头发和肝脏样本（图3）。虽然信号强度更大的肝脏样本时，这没有一个基因型得分的不利影响（图3）。使用AFLPs（图4），线粒体DNA序列（图5），ZFX / ZFY的分子绝育标记（图6）时，取得了类似的结果。 图1：成立一个非侵入性的头发圈套的例子在干草堆里。卷起的透明包装胶带条被安排在一个类似Web的时尚括干草堆里的入口。这里使用的是一块鱼线，为头发圈套提供更多的支持。 图2：一个成功的头发含有大量的包装胶带粘到头发的圈套。 图3显示一个有代表性的核微色谱（Ocp6）8 Genemapper v3.7（美国应用生物系统公司）。顶部色谱放大DNA从肝组织，是杂合子（358分之354）在该位点。底部色谱代表不同的个体表现出杂合基因型（362分之358）从头发中提取的DNA为基础。虽然从头发样本的色谱信号肝脏样品的比强度较低，基因型得分没有这种信号的差异造成不利影响。 图4。Genemapper v3.7（美国应用生物系统公司）显示一个代表性的AFLP色谱（E31T32）。顶部色谱放大DNA从肝组织中，底部色谱代表从头发中提取的DNA。 图5。一个有代表性的线粒体DNA序列图（细胞色素b）Sequencher V4.7（基因代码公司）显示。顶部色谱放大DNA从肝组织中，底部色谱代表从头发中提取的DNA。 图6。代表的分子绝育标记（ZFX / ZFY），肝脏和头发样本扩增。这种方法依赖于观察，Y染色体拥有在该地区的HinfI酶切位点，位于X染色体上缺乏。因此，雌性产生的432 bp的两个合作迁移的片段，而男性产生432基点，261 bp和171 bp的片段。