Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

1. Haar snare Voorafgaand aan het opzetten van een snare, een ideale locatie moet worden bepaald binnen de pika habitat of talus helling. Dit geldt ook voor hooi palen, die zijn vegetatie caches dat de dieren te verzamelen in de nazomer evenals verse scats gevonden op latrine sites. Stroken tape (10-50cm in de lengte) worden opgerold om een ​​360 ° plakkerig oppervlak te verkrijgen en zijn gerangschikt in een web-achtige wijze envelop de ingang van hooi van de pika's paal (fig. 1) of latrine site. Afhankelijk van de configuratie van de rotsen, kan een stuk vislijn worden gebruikt om de structuur van het haar snare te ondersteunen, maar dit is vaak niet nodig als ingangen zijn vrij klein (<30 cm in diameter), een volledige beschrijving van het gebruik van vislijn kan worden gevonden in Henry en Russello (2010) 3. Haar strikken worden zo vaak gecontroleerd als mogelijk, en haar monsters afgezet op de tape (fig. 2) worden vervolgens verzameld en gelabeld. Eenmaal terug naar het lab vervoerd, zijn haren uit het plakband met steriele pincet en overgebracht naar cryogene buizen en opgeslagen bij -20 ° C tot manipulatie. Haarmonsters samen gebundeld worden op een haar strik worden beschouwd als te behoren tot een enkel individu, terwijl de monsters onafhankelijk van elkaar geclusterd worden verondersteld te behoren tot verschillende individuen. In het laatste geval is het haar vervolgens in verschillende buizen. Deze veronderstellingen kunnen later worden getest door middel van DNA-vingerafdrukken en berekeningen van de waarschijnlijkheid van identiteit op basis van microsatelliet genotypische gegevens. 2. DNA-extractie Omdat pika haar is erg dun en bevat een kleine wortel gloeilamp, hebben we eerder aangetoond dat een minimum van 25 haren nodig zijn om voldoende hoeveelheden DNA te verkrijgen voor een goede kwaliteit downstream PCR-amplificatie 3. We gebruikten het DNA-IQ systeem (Promega, Madison, WI, USA) en een iets aangepaste versie van de instructies van de fabrikant voor DNA-isolatie uit haar monsters. Ten eerste is het haar monster afgedraaid in een micro-centrifuge om het verlies van haar te voorkomen, terwijl het openen van de buis. Dan is de incubatie-oplossing wordt bereid door het mengen van 80 ul van incubatie-oplossing met 10μl van DTT (1M) en 10μl van proteïnase K (18ng/ml) te resulteren in een uiteindelijke concentratie van 0,1 M DTT en 1.8ng/ml van proteïnase K. Incubation oplossing (100 ul) wordt toegevoegd aan het monster en geïncubeerd bij 56 ° C gedurende 1 uur. In de tussentijd is de lysis oplossing bereid door toevoeging van 1 pi van DTT (1M) voor elke 100 ul van lysis buffer, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van 0,01 M DTT. Bereid lysis oplossing (200 ul) wordt vervolgens toegevoegd aan het monster, samen met zeven pi DNA IQ hars, gevortext gedurende 3 seconden op hoge snelheid en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Het monster wordt vervolgens gevortext 2 seconden en ingevoegd in de magnetische stand, waar de scheiding van magnetische beads uit de oplossing komt. De resterende oplossing wordt vervolgens afgezogen en weggegooid, dat evenwel niet tot de pellet van magnetische hars verstoren. Het monster wordt vervolgens behandeld met 100 ul van de bereide lysis oplossing, gevortext en keerde terug naar de magnetische staan ​​waar scheiding zich opnieuw voordoet. De lysis buffer is opgezogen en verwijderd, en deze stap wordt drie keer herhaald met behulp van een wasbuffer (100 pl). Het monster wordt vervolgens te drogen in de magnetische 15 minuten staan. Eenmaal droog is, wordt 100 ul elutiebuffer toegevoegd aan het monster en geïncubeerd bij 65 ° C gedurende 5 minuten. Het monster wordt gevortexed en ingevoegd in de magnetische stand. De oplossing nu met het geëlueerde DNA wordt vervolgens overgebracht naar een 1,5 ml Eppendorf buis en opgeslagen bij -20 ° C tot verdere manipulaties. DNA van de lever monsters werd ook geëxtraheerd met behulp van de DNA-IQ systeem en gebruikt als een positieve controle voor PCR amplificaties. 3. PCR-amplificatie De DNA verkregen uit onze niet-invasieve haren snare en lever monsters werden vervolgens gebruikt om een ​​reeks van veel gebruikte moleculaire merkers (microsatelliet, AFLP, mitochondriale cytochroom B en ZFX / ZFY geslachtsbepaling marker) te versterken. PCR's werden uitgevoerd met behulp van een Veriti thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in een 25 ul volume met: 10 – 20 ng DNA, 0,5 uM van elke primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 uM dNTPs, 10 μ bovine serum albumine (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) en 0,5 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems). Fietsen parameters voor de microsatelliet loci werden geoptimaliseerd met behulp van een touchdown fietsen programma (10 min bij 95 ° C, 35 cycli bij 95 ° C gedurende 30 s, 30 s gloeien, en 45 s bij 72 ° C, gevolgd door een laatste stap bij 72 ° C gedurende 10 min). De annealing temperatuur daalde met 1 ° C per cyclus 60 tot 55 ° C tot het bereiken van de zesde cyclus, op welk punt de 29 resterende cycli voortgezet bij 55 ° C. Fietsen parameters voor de mitochondriale fragmenten werden zoals hierboven beschreven, maar bestond uit 35 cycli met een gloeientemperatuur van 50 ° C. Amplified Fragment Length Polymorphism werd uitgevoerd volgens het protocol voor de gewervelde genomen beschreven door Bonin 4. Ten slotte werd de moleculaire geslachtsbepaling uitgevoerd met behulp van de PCR-RFLP van ZFX / ZFY loci met HinfI restrictie-enzym digestie 5. De PCR-producten uit de microsatelliet, AFLPs en cytochroom B sequenties werden uitgevoerd op een ABI 3130XL genetische analyzer (Applied Biosystems), terwijl verteerd ZFX / ZFX fragmenten werden uitgevoerd naast een 100 bp ladder (New England Biolabs) op een 3% agarose gel met 2,5% SYBR Safe DNA gel vlek (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en gevisualiseerd met behulp van een RODE persoonlijke gel imaging-systeem (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). Microsatelliet en AFLPs werden gevisualiseerd met behulp van Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) en het mitochondriale DNA chromatogram werd gevisualiseerd met behulp van Sequencher v4.7 (Gene Code Corporation, Ann Harbour, MI, USA). 4. Representatieve resultaten Het DNA uit haar monsters verkregen met behulp van onze niet-invasieve snare werden gebruikt om PCR versterken de verschillende type van moleculaire merkers. Als basis voor vergelijking, DNA geëxtraheerd met behulp van de lever monsters werd versterkt samen met ons haar monsters. Nucleaire microsatelliet loci werden met succes versterkt voor zowel haar en lever monsters (afb. 3). Hoewel de intensiteit van het signaal was groter bij gebruik van de lever monsters, heeft dit geen negatief effect op genotype scoren (afb. 3). Vergelijkbare resultaten werden bereikt bij het gebruik van AFLPs (afb. 4), mitochondriale DNA-sequenties (Fig. 5), en de ZFX / ZFY moleculaire marker geslachtsbepaling (Fig. 6). Figuur 1. Een voorbeeld van een niet-invasieve haar valstrik opgezet op een stapel hooi. Stroken van opgerolde duidelijk verpakkingstape zijn gerangschikt in een web-achtige manier naar de ingang van het hooi stapel omsluiten. Een stuk van de visserij lijn wordt hier gebruikt om extra steun voor het haar snare te bieden. Figuur 2. Een succesvol haar snare met een groot aantal van haar vast aan de tape te verwijderen. Figuur 3. Een vertegenwoordiger nucleaire microsatelliet chromatogram (Ocp6) 8 in zoals getoond in Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). De top chromatogram werd verkregen door het amplificeren van DNA van leverweefsel, en is heterozygoot (354/358) op dit locus. De onderste chromatogram staat voor een andere persoon vertoont een heterozygoot genotype (358/362) op basis van DNA uit haar. Terwijl het signaal van chromatogram van het haar monster heeft een lagere intensiteit dan de lever monster wordt genotype scoren niet nadelig beïnvloed door dit verschil in signaal. Figuur 4. Een vertegenwoordiger AFLP chromatogram (E31T32) zoals weergegeven in Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). De top chromatogram werd verkregen door het amplificeren van DNA van leverweefsel, de onderste chromatogram staat voor de DNA geëxtraheerd uit haar. Figuur 5. Een vertegenwoordiger mitochondriaal DNA-sequentie chromatogram (cytochroom B) zoals weergegeven in Sequencher v4.7 (Gene Code Corporation). De top chromatogram werd verkregen door het amplificeren van DNA van leverweefsel, de onderste chromatogram staat voor de DNA geëxtraheerd uit haar. Figuur 6. Een vertegenwoordiger moleculaire marker geslachtsbepaling (ZFX / ZFY) versterkt voor zowel de lever en haar monsters. Deze aanpak is gebaseerd op de waarneming dat het Y-chromosoom een ​​HinfI restrictieplaats in deze regio dat het X-chromosoom mist bezit. Dus, vrouwen produceren twee co-migratie van fragmenten van 432 bp, terwijl mannetjes produceren van fragmenten van 432 bp, 261 bp en 171 bp.