הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

1. Dissection עצמות הירך העכבר tibiae והתרבות של תאים במח העצם הקורבן 2 עכברים בחנק CO 2 ובזהירות לנתח tibias ואת עצמות הירך ללא חיתוך קצות העצם. נקו את העצמות מכל הרקמות המצורף על ידי שימוש בנייר טישו. היזהר שלא לשבור את העצמות. לעקר את העצמות על ידי טבילה באתנול 70% עבור 10 דקות בצלחת פטרי 35 מ"מ. מרגע זה, לעבוד בתוך ברדס biosafety כדי למנוע זיהום של תרביות תאים. שחזר את העצמות מן אתנול ולתת להם אוויר יבש 5 דקות בצלחת פטרי בתוך ארון biosafety. חותכים את עצמות הירך לשניים, ואת עצם השוק על ידי קצה הדק שלה. להשרות את החלק הפנימי של העצם עם 1 מ"ל של מדיום RPMI (ללא בסרום אך עם אנטיביוטיקה) באמצעות מזרק סטרילי על צלחת פטרי סטרילית. ההשעיה התא נאספים ורחץ 2X במדיום RPMI ידי צנטריפוגה 10 דקות ב צינור 15 צנטריפוגות מ"ל ב 1100 סל"ד בצנטריפוגה קירור (4 ° C) עם הרוטור דלי מתנדנד. לאחר לשטוף האחרון, resuspend התאים מ"ל 2 של חיץ תמוגה ACK ו דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסל כדוריות דם אדומות. הוסף 13 מ"ל של RPMI עם 10% FBS, resuspend ולשטוף 2X במדיום הזה עם אותן הגדרות כפי שמתואר 1.6. ספירת תאים, להסתגל 2 x 10 5 תאים / מ"ל עם RPMI 10% FBS, ולהוסיף rm-GM-CSF (20 ng / ml הריכוז הסופי) 5. הוסף 10 מ"ל של השעיה זו איכות, סטרילי מיקרוביולוגית, צלחת פטרי 10 ס"מ, והתרבות 2 CO אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). שלושה ימים לאחר מכן, להוסיף עוד 10 מ"ל של RPMI 10% FBS עם 20 ng / l של rmGM-CSF לכל אחד צלחות מוכן. שלושה ימים לאחר מכן 10 מ"ל של השעיה סלולריים הם התאושש מנה פטרי, centrifuged כמו 1.6, resuspended בהיקף זהה של 10% RPMI FBS עם rmGM-CSF וחזר צלחת פטרי. בתרבית תאים הם עבור 2 ימים נוספים של CO 2 באינקובטור. 2. אוסף וסימון של DCs לאחר 8 ימים בתרבית תאים חסיד רופף הם התאוששו על ידי שטיפת צלחות פטרי עם מדיום חדש. פרוטוקול זה הופך סביב 2-4 x10 8 DCs בידינו. תאים ניתן לנתח עבור פנוטיפ DC ידי cytometry הזרימה. תאים שנאספו מסומנים אז עם קיט 655 Qtracker תיוג Cell בהחלט הבאים הוראות היצרן. יש לנו תוצאות מצוינות תיוג מח עצם הנגזרות Murine DCs עם Qdots בריכוז 10 ננומטר. כדי להשיג זאת, aliquots של תא Qtracker רכיבים תיוג Kit A ו-B מעורבים בכמויות שוות, מודגרות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, וכן בדילול מלא מיד 1 / 100 בינוני טרי עם vortexing עבור 30 s. כדי להכתים 5 x 10 6 DCs, לערבב 5 μl של כל הרכיבים בערכה A ו-B בצינור Eppendorf ו דגירה של 5 דקות על טמפ החדר. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של דגירה RPMI FBS 10%, ו מערבולת לשנייה 30. הוסף 0.5 מ"ל של השעיה התא המכיל 5 6 DCs x10 ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר מכן, לשטוף תאים 2X ב RPMI 10% FBS (1,100 סל"ד). תאים יכולים להיות resuspended ב RPMI לתרבות נוספת או PBS להזרקה בעכברים ניסיוני. 3. הערכת DC שכותרתו תיוג Cell ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי להשיג זאת, ירידה של השעיה תא מתווסף המיקרוסקופ שקופית, מכוסה coverslip זכוכית, ומוערכת עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לקחת בחשבון כי Qdots אלה פליטת ספקטרום עירור של 565nm-525nm ו – 405 בהתאמה (איור 3 ) בשלב זה, התאים שכותרתו ניתן להזריק בעלי חיים, או התבגרות יכול להיגרם על ידי דוגרים תאים אלה במשך 48 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5 CO 2) בנוכחות LPS (100 ng / ml) ו-TNF ( 20 ng / ml). תיוג פלורסנט אינו מושפע התבגרות DC (איור 4). 4. נציג תוצאות: בזאת אנו תיאר כיצד להכין מח עצם הנגזרות Murine DCs ואיך שכותרתו אותם עם Qdots ניאון. איור. 1 מסכמת את ההליך כדי לקבל את התא, בעוד איור. 2 מתאר את הליך לתייג אותם עם Qdots. כפי שמוצג באיור. 3, כמעט כל התאים מסומנים על ידי הליך זה, והדבר אינו מושפע התבגרות DC עם גורמים דלקתיים (איור 4). איור. 5 מראה כי Qdot מוכתם DCs (Fig.5a) להתנהג בדומה הלא מוכתם תאים כאשר טופלו עם קוקטייל דלקתית. שתי ההכנות תא דומה upregulate ביטוי של מולקולות costimulatory (איור 5 ב); לייצר כמויות דומות של IL-6 (איור 5c) ו תחמוצת החנקן (איור 5d) על גירויים התבגרות. זה מסכים עם previהנתונים שפורסמו המפוקפקת המציין כי מכתים Qdot אינו משפיע על היכולת של DC להפוך תאים בוגרים מסוגלים לעורר תגובות חיסוניות [6]. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש להזרקת חיות הניסוי. כפי שמוצג באיור. 6, 2 ימים לאחר הזרקה תוך ורידית של DCs שכותרתו לעכברים, הצלחנו לזהות Qdot מוכתמת תאים בטחול. זהו גם הסכם עם הנתונים שפורסמו הקודם מראה את השימוש של nanocrystals Qdot להעריך ההגירה של DC in vivo [6] על ידי הדמיה לא פולשנית ו cytometry הזרימה. 1. תרשים זרימה תרשים של הדור DC ממח העצם. בזאת אנו מתארים את תהליך השגת מוח העצם הנגזרות DC. שני tibias ואת עצמות הירך הם גזור ונקי מן הרקמה הסובבת. טיפים העצם נשמרים הפנימי של העצמות הן סמוקות בינוני. לאחר ביטול כדוריות דם אדומות, תאים במח העצם הם מתורבתים במשך 8 ימים בנוכחות GM-CSF כדי לבדל אותם DCs. 2. איור תרשים זרימה של תהליך התיוג. Aliquots שוויון של תא Qtracker רכיבים תיוג Kit A ו-B מעורבבים בצינור Eppendorf. התאים הדנדריטים הם שנאספו 8 יום מח עצם תרבויות עם GM-CSF ו מעורבב עם צבע את התוויות עבור 60 דקות ב 37C. ואז התאים נשטפים בתקשורת לחסל חלקיקים תיוג עודף. איור 3. Microphotography פלורסנט של DCs מיד לאחר תיוג. ירידה של תאים שכותרתו הופקד בשקופית זכוכית מכוסה על ידי coverslip. ואז, דגימות הוערכו ב מיקרוסקופ פלואורסצנטי ותמונות נרכשו באמצעות מצלמה דיגיטלית 5.0 Micropublisher CCD צבע (Qimaging, Surrey, BC קנדה). איור 4. Microphotography פלורסנט של DCs לאחר ההבשלה h 48 במבחנה. DCs תווית היו בתרבית במשך 48 שעות עם LPS (100 ng / ml) ו – TNF-α (20 ng / ml) בשקופיות זכוכית על 2 CO אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). ואז, דגימות נשטפו עם PBS (5 דקות, 2X), קבוע עם אצטון (15 דקות, 4 ° C) counterstained עם DAPI. תאים הוערכו ב מיקרוסקופ פלואורסצנטי לעיל. איור 5. פעילות ביולוגית של Qdot DCs בוגרת מוכתם. DCs תווית התבגר במבחנה לעיל נותחו על ידי cytometry זרימה (א) ו – (ב). (א) Qdot מוכתמת תאים לתת איתות חזק בערוץ FL3 (PercP). מוצלל היסטוגרמה: שליטה בלא כתם. (ב) DCs Qdot מוכתמת בלא כתם היו מוכתמים בנוסף עם נוגדנים ספציפיים כנגד סמנים התבגרות CD86 ו CD40, בקרות אלוטיפ. תאים נותחו אז cytometer זרימה FACSort (בקטון דיקינסון, בסן חוזה, קליפורניה). בנוסף, IL-6 (ג) ו – תחמוצת החנקן (NO) נקבעו supernatants של Qdot מוכתם DCs בוגרת שולטת. רמות IL-6 ו – תחמוצת החנקן נקבעו באמצעות ניתוח ELISA ו assay Griess כפי שתיארנו בעבר 7, 8. כל הנתונים הראו בנתון זה הוא נציג של שניים או שלושה ניסויים בלתי תלויים מראים תוצאות דומות. הנתונים נותחו על ידי ANOVA באמצעות תוכנת GraphPad. איור 6. גילוי DCs שכותרתו ברקמות גזור. DCs בוגרת תווית (1×10 6 תאים) הוזרקו לעכברים לווריד C57BL / 6. (א) יומיים לאחר מכן העכברים הוקרבו ו spleens שנאספו, הצמד קפוא, מוטבע אוקטובר, ו – 8 חלקים מיקרומטר מוכן באמצעות cryostat. ואז, דגימות תוקנו עם אצטון (15 דקות, 4 ° C) counterstained עם DAPI. תאים הוערכו ב מיקרוסקופ פלואורסצנטי לעיל איור 6 א:. בהגדלה 40X, איור 6 ב: בהגדלה 100x, איור. 6C, 400X ההגדלה.