Generazione e l'etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

1. Dissezione di femori e tibie del mouse e della cultura di cellule del midollo osseo Sacrificio 2 topi da CO 2 asfissia e con attenzione sezionare tibie e femori senza tagliare le estremità delle ossa. Pulire le ossa da tutti i tessuti attaccati utilizzando carta velina. Fare attenzione a non rompere le ossa. Sterilizzare le ossa per immersione in etanolo al 70% per 10 minuti in una capsula di Petri 35 millimetri. Da questo momento, il lavoro all'interno di una cappa di biosicurezza per evitare la contaminazione delle colture cellulari. Recuperare le ossa dal etanolo e lasciarli asciugare per 5 minuti in una capsula di Petri all'interno del cabinet biosicurezza. Tagliare i femori a metà, e la tibia con la sua punta più sottile. Infondere la parte interna dell'osso con 1 ml di terreno RPMI (senza siero ma con antibiotici) utilizzando una siringa sterile in una piastra di Petri sterile. La sospensione cellulare viene raccolto e lavato 2X in RPMI medio di 10 min centrifugazione in una provetta da 15 ml per centrifuga a 1.100 RPM in una centrifuga refrigerata (4 ° C) con un rotore oscillante. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in 2 ml di tampone di lisi ACK e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per eliminare i globuli rossi. Aggiungere 13 ml di RPMI con 10% FBS, risospendere e lavare 2X in questo mezzo con le stesse impostazioni, come descritto in 1.6. Contare le celle, regolare a 2 x 10 5 cellule / ml con RPMI 10% FBS, e aggiungere rm-GM-CSF (20 ng / ml concentrazione finale) 5. Aggiungere 10 ml di questa sospensione ad una sterile, qualità microbiologica, 10 centimetri piatto di Petri, e la cultura in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). Tre giorni dopo, aggiungere altri 10 ml di RPMI 10% FBS con 20 ng / l di rmGM-CSF a ciascuno dei piatti preparati. Tre giorni dopo, 10 ml di sospensione cellulare vengono recuperati da ciascuna piastra di Petri, centrifugato come in 1.6, risospeso nello stesso volume di RPMI 10% FBS con rmGM-CSF e restituito alla piastra Petri. Le cellule sono coltivate per 2 giorni aggiuntivi in CO 2 incubatore. 2. La raccolta e l'etichettatura dei PVS Dopo 8 giorni di coltura le cellule debolmente aderenti sono recuperati dal lavare i piatti di Petri con terreno fresco. Questo protocollo rende circa 2-4 x10 8 DC nelle nostre mani. Le celle possono essere analizzati per fenotipo DC mediante citometria di flusso. Cellule raccolte vengono poi etichettati con il kit 655 celle Qtracker Etichettatura rigorosamente seguendo le istruzioni del produttore. Abbiamo ottenuto ottimi risultati etichettatura derivate dal midollo osseo murino DC con Qdots ad una concentrazione 10 nM. Per fare questo, aliquote di componenti Etichettatura Qtracker cellulare Kit A e B sono mescolati in volumi uguali, incubate per 5 minuti a temperatura ambiente, e subito diluito 1 / 100 in un mezzo fresco con vortex per 30 s. A macchia 5 x 10 6 DC, mescolare 5 ml di ciascuno i componenti del kit A e B in una provetta Eppendorf e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 1 ml di incubare RPMI 10% FBS, e vortex per 30 secondi. Aggiungere 0,5 ml di sospensione cellulare contenente 5 x10 6 DC, e incubare a 37 ° C per 60 min. Poi, lavare le cellule 2X in RPMI 10% FBS (1.100 rpm). Le celle possono essere risospese in RPMI per la cultura più o in PBS per l'iniezione nei topi sperimentali. 3. Valutazione della DC etichettati L'etichettatura delle cellule possono essere valutati mediante microscopia a fluorescenza. Per fare questo, una goccia di sospensione cellulare viene aggiunto a un vetrino da microscopio, coperta con un coprioggetto di vetro, e valutata con un microscopio a fluorescenza tenendo conto che questi Qdots hanno spettri di emissione e di eccitazione di 565 nm e 405-525nm, rispettivamente (Fig. 3 ) A questo punto, le cellule etichettate può essere usata per iniettare gli animali, o la maturazione può essere indotta da incubando queste cellule per 48 ore (37 ° C, 5 CO 2) in presenza di LPS (100 ng / ml) e TNF-( 20 ng / ml). Fluorescente etichettatura non è influenzato dalla maturazione DC (Fig. 4). 4. Rappresentante dei risultati: Con la presente abbiamo descritto come preparare derivate dal midollo osseo murino DC e come li etichettati con Qdots fluorescenti. Fig. 1 riassume la procedura per ottenere le cellule, mentre la fig. 2 mostra la procedura di etichettarli con Qdots. Come mostrato in fig. 3, quasi tutte le cellule sono etichettati da questa procedura, e questo non è influenzato dalla maturazione DC con fattori infiammatori (Fig. 4). Fig. 5 mostra che Qdot macchiato di DC (Fig.5a) si comportano simili a cellule non colorate quando vengono trattati con un cocktail infiammatorio. Entrambe le preparazioni cellulari similmente upregulate espressione delle molecole co-stimolatorie (Fig. 5b), e producono quantità simili di IL-6 (fig. 5c) e l'ossido nitrico (Fig. 5d) sugli stimoli maturazione. Questo concorda con preceOU dati pubblicati indicano che Qdot colorazione non influisce sulla capacità di DC di trasformarsi in cellule mature capaci di suscitare risposte immunitarie [6]. Queste cellule possono quindi essere utilizzati per l'iniezione animali da esperimento. Come mostrato in fig. 6, 2 giorni dopo l'iniezione endovenosa di DC etichettati in topi, siamo stati in grado di rilevare Qdot macchiato di cellule nella milza. Questo è anche in accordo con precedenti dati pubblicati mostrano l'utilizzo di nanocristalli Qdot per valutare la migrazione delle DC in vivo [6] di imaging non invasiva e di citometria a flusso. Figura 1. Diagramma di flusso della generazione di corrente continua dal midollo osseo. Con la presente si raffigurano il processo per ottenere dal midollo osseo DC. Entrambe le tibie e femori sono sezionati e puliti dal tessuto circostante. Suggerimenti ossa sono conservate e l'interno delle ossa sono lavata con media. Dopo aver eliminato i globuli rossi, le cellule del midollo osseo sono coltivate per 8 giorni in presenza di GM-CSF per differenziarle in PVS. Figura 2. Diagramma di flusso della procedura di etichettatura. Aliquote uguali di componenti Etichettatura Qtracker cellulare Kit A e B sono mescolati in un tubo eppendorf. Le cellule dendritiche sono raccolti da culture osso di 8 giorni midollo con GM-CSF e miscelato con la tintura di etichettatura per 60 minuti a 37 ° C. Quindi le cellule vengono lavate in media per eliminare le particelle di etichettatura in eccesso. Figura 3. Microfotografia fluorescente di DC subito dopo l'etichettatura. Una goccia di cellule marcate è stato depositato su un vetrino e coperta da un coprioggetto. Poi, i campioni sono stati valutati in un microscopio a fluorescenza e le immagini sono state acquisite attraverso un 5,0 Colore Micropublisher fotocamera digitale CCD (Qimaging, Surrey, BC Canada). Figura 4. Microfotografia fluorescente di DC dopo 48 ore di maturazione in vitro. DC etichettati sono state coltivate per 48 ore con LPS (100 ng / ml) e TNF-α (20 ng / ml) su vetrini su un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). Poi, i campioni sono stati lavati con PBS (5 min, 2X), fissate con acetone (15, min 4 ° C) e di contrasto con DAPI. Le cellule sono state valutate in un microscopio a fluorescenza come sopra. Figura 5. L'attività biologica del Qdot DC macchiato maturo. DC etichettati maturato in vitro di cui sopra sono stati analizzati mediante citometria di flusso (A) e (B). (A) Qdot macchiato di cellule dare un segnale forte nella (PerCP) canale FL3. Ombreggiato istogramma: controllo senza macchia. (B) DC Qdot macchiato e senza macchia sono stati ulteriormente colorate con anticorpi specifici contro la maturazione marker CD86 e CD40, e controlli isotipo. Le cellule sono state poi analizzate in un citofluorimetro FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA). Inoltre, IL-6 (C) e l'ossido nitrico (NO) sono stati determinati in surnatanti di maturità Qdot macchiati di DC e controlli. I livelli di IL-6 e l'ossido di azoto sono stati determinati per mezzo di analisi e test ELISA Griess come abbiamo descritto precedentemente 7, 8. Tutti i dati hanno mostrato in questa figura è rappresentativa di due o tre esperimenti indipendenti che mostrano risultati simili. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA utilizzando il software GraphPad. Figura 6. Rilevamento delle DC marcati nei tessuti sezionati. Etichettati DC mature (1×10 6 celle) sono state iniettate endovena in topi C57BL / 6. (A) Due giorni dopo i topi sono stati sacrificati e milza raccolti, congelati a scatto, integrati in ottobre, e 8 sezioni mM preparati utilizzando un criostato. Poi, i campioni sono stati fissati con acetone (15, min 4 ° C) e di contrasto con DAPI. Le cellule sono state valutate in un microscopio a fluorescenza come sopra Fig. 6a:. Ingrandimento 40X, Fig. 6b: ingrandimento 100X, fig. 6C, ingrandimento 400X.