تحديد الهياكل الجزيئية لفيروس نقص المناعة البشرية جليكوبروتينات مغلف باستخدام البرد الكترون والتصوير المقطعي الآلي متوسط الفرعية صورة مقطعية
1Laboratory of Cell Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute,National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit,University of Cambridge , 3National Library of Medicine,National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia , 7Duke University , 8Yale University, 9University of Notre Dame , 10Washington University in St. Louis , 11Bioinformatics and Computational Biosciences Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases,National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
Summary
بروتوكول يصف نهجا الإنتاجية العالية لتحديد هياكل للبروتينات غشاء به البرد الإلكترون التصوير المقطعي 3D ومعالجة الصور. وهو يغطي تفاصيل إعداد العينات وجمع البيانات ومعالجة البيانات وتفسيرها ، ويختتم إنتاج هدفا ممثل للنهج ، وHIV – 1 مغلف بروتين سكري. وقد صممت هذه الإجراءات الحسابية في الطريقة التي تمكن الباحثين والطلاب للعمل عن بعد والمساهمة في معالجة البيانات والتحليل البنيوي.
Abstract
منذ اكتشافه قبل 30 عاما تقريبا ، وقد أصيب أكثر من 60 مليون شخص بفيروس نقص المناعة البشرية (الإيدز) (www.usaid.gov) . الفيروس يصيب ويدمر خلايا CD4 + T – الخلايا مما يشل الجهاز المناعي ، وتسبب متلازمة نقص المناعة المكتسب (الايدز) 2. تبدأ العدوى عندما بروتين سكري مغلف فيروس نقص المناعة البشرية "زيادة" يجعل الاتصال مع مستقبلات CD4 على سطح خلايا CD4 + T – الخلية. هذا التفاعل يؤدي الى تغيير متعلق بتكوين جزئي في ارتفاع ، والذي يعزز التفاعل مع سطح الخلية الثانية شارك في مستقبلات 5،9. المغزى من هذه التفاعلات البروتينية في مسار عدوى فيروس نقص المناعة البشرية يجعلها ذات أهمية عميقة في مجال البحوث الأساسية فيروس نقص المناعة البشرية ، وسعيا وراء لقاح مضاد لفيروس نقص المناعة البشرية
الحاجة إلى فهم أفضل للتفاعلات الجزيئية النطاق للاتصال الخلية فيروس نقص المناعة البشرية وتحييد الدافع وراء تطوير تقنية لتحديدهياكل ارتفاع فيروس نقص المناعة البشرية تتفاعل مع بروتينات مستقبلات سطح الخلية والجزيئات التي العدوى كتلة. باستخدام التصوير المقطعي البرد الإلكترون ومعالجة الصور 3D ، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت القدرة على تحديد هذه الهياكل الموجودة على سطح الفيروس الأصلي ، في قرار من 20 ~ 9،14. ولا يقتصر هذا النهج في حل هياكل مغلف فيروس نقص المناعة البشرية ، ويمكن أن تمتد إلى غيرها من البروتينات الفيروسية وبروتينات الغشاء على تشكيل الحويصلية. في هذا البروتوكول ، ونحن تصف كيفية الحصول على هياكل جليكوبروتينات المغلف فيروس نقص المناعة البشرية بدءا من فيروس نقص المناعة البشرية virions المنقى والمتابعة خطوة بخطوة من خلال تحضير عينات المزجج ، وجمع البيانات المجهري البرد الإلكترون ، وإعادة تشكيل وتجهيز وحدات تخزين بيانات 3D ، بمتوسط وتصنيف subvolumes البروتين 3D ، و تفسير نتائج لإنتاج نموذج البروتين. تم تكييف الجوانب الحسابية لنهجنا في الوحدات التي يمكن الوصول إليها وتنفيذها عن بعد باستخدام جنو / لينكس Biowulf موازية عالكتلة rocessing في المعاهد الوطنية للصحة (http://biowulf.nih.gov) . وقد جعل هذا الوصول البعيد ، جنبا إلى جنب مع أجهزة الكمبيوتر منخفضة التكلفة وعالية السرعة الوصول إلى الشبكة ، من الممكن إشراك الباحثين والطلاب العاملين من المدرسة أو المنزل.
Protocol
وقد تم تطوير هذا النهج وصفها هنا باستخدام مجموعة محددة من أدوات ، والأدوات والبرمجيات. لأن جميع مختبرات لن تستخدم هذا الإعداد نفس تجريبية ، وبذلت جهود لتعميم النهج حيثما كان ذلك ممكنا ، وتوفير بدائل حيث لم يكن ذلك ممكنا. 1. إعداد عينات الفيروس المزجج في المقطع التالي مستعدون شبكات المزجج باستخدام Vitrobot الاتحاد الدولي للفروسية مارك الثالث ، وهو تجميد يغرق النشاف والروبوت. انظر ايانكو ، وآخرون. لبروتوكول مفصلة حول كيفية استخدام هذا النظام 7. كبديل لالمكبس الروبوتية ، وهو الغواص المقصلة الطراز أو خطورة كافية تماما 6. في القسمين 1.2. و 1.3. يستخدم Solarus غاتان تصريف توهج 950 وحدة لتنظيف شبكات العينة وزيادة hydrophilicity بهم ، وإن كان يمكن أن تكون بديلا لأي جهاز تفريغ توهج مصممة للاستخدام مع شبكات المجهر الإلكتروني. محتوى "> على الرغم من أن مقدار حجم العينة المطبقة على الشبكة قبل النشاف وتجميد الغطس يجب أن تكون في حدود 2 ميكرولتر ، فإن الفيروس وبروتين – A حجم غرواني الذهب في خليط العينة تختلف حسب المصدر. وعلى هذا النحو ، ومن المرجح أن عددا من الفيروسات والتخفيفات الذهب أو نسب سيتعين اختبار وتصوير في المجهر ، ومزيج مثالي يحدد تجريبيا لاحظ أنه عندما يتم الحصول على بيانات الصور في القسم 3 ، ما بين 10 و 20 علامات إيمانية الذهب ينبغي يكون حاضرا لمناسبة مغطاة محاذاة السلسلة. تنبيه : هذا القسم يصف استخدام الايثان الغازية ، والهيدروجين ، والأكسجين التي هي شديدة الاشتعال. وينبغي اتخاذ الحذر عند استخدام هذه المناسبة الغازات. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي الحرص على التعامل مع عينات الفيروس وفقا لتوصيات السلامة الأحيائية. أخيرا ، وارتداء النظارات الواقية دائما عند التعامل مع الملابس والنيتروجين السائل (N 2) والإيثان. يعد الاتحاد الدولي للفروسية Vitrobot ماركالثالث والخمسين عن طريق تشغيل N 2 امدادات الغاز ، وتركيب خرطوشة المرطب ثم ملء خرطوشة مع الماء منزوع الأيونات التي تمت تصفيتها. السلطة في Vitrobot وتعيين درجة الحرارة إلى 22 غرفة المناخ درجة مئوية والرطوبة إلى 100 ٪ المستهدفة ، والوقت النشاف إلى 6 ثوانى ، وصمة عار لتعويض -2 مم. الطاقة على Solarus غاتان 950 وحدة توهج التفريغ وفتح H 2 O 2 وقنابل التي تزود الوحدة. قبل تنظيف الغرفة عينة عن طريق تشغيل التفريغ للتوهج 1 دقيقة بمعدل 50 واط. ترتيب العدد المرغوب فيه من شبكات الكربون holey ساترة على الزجاج ، وحتى الجانب الكربون ، ومكان داخل غرفة تفريغ توهج العينات من خلال الباب تحميل أعلى. تنظيف شبكات التصريف عن طريق تشغيل توهج ل60-10 ثانية عند 25 واط. (لاحظ أن الجانب الكربون من شبكات Quantifoil العلامة التجارية المستخدمة في هذا البروتوكول هي في مظهر غير لامع ، وهذا لن يكون صحيحا بالنسبة لجميع الشبكات التجارية لذلك فمن الأفضل الحصول على هذه المعلومات من الشركة المصنعة). مكان مربع الشبكة (وفاق) داخل سجعlant عاء الحاويات ، والحرارية المغزل الناشر على الكأس المركزي الذي يجلس داخل وعاء التبريد. صب السائل N 2 ببطء في وعاء حتى تهدأ محتدما قوية ، مشيرا الى توازن بين وعاء والسائلة. الحفاظ على السائل N 2 المستوى طوال الفترة المتبقية من هذا الإجراء ، مع الحرص على الحفاظ عليه للخروج من كأس المركزية. إرفاق واحدة من نهاية خرطوم البلاستيكية لاسطوانة غاز الإيثان ، والطرف الآخر إلى ماصة الزجاج. عقد الزجاج ماصة تلميح إلى قاع الكأس المركزية ، وإنشاء بطيئة ، وتدفق الإيثان ثابتة ، والإيثان ستبدأ التكثيف. مواصلة التعبئة حتى كوب المركزية الكاملة. إزالة المغزل من كأس المركزية. تحضير خليط العينة بإضافة 2 – A البروتين ميكرولتر غرواني الذهب إيمانية إلى 10 ميكرولتر AT – 2 المعطل HIV – 1 تعليق الفيروس. ماصة الخليط برفق لجلب fiducials الى حل. تبقي على الجليد. فهم الحافة الخارجية من الشبكة مع ملاقط Vitrobot المتخصصة. تطبيق 2 ميكروليتر من عينة لخليط الكربون قIDE من الشبكة. إرشاد الروبوت على الفور لتحميل عينة لطخة في ترطيب المناخ ، وتجميد الغرفة يغرق في الإيثان السائل. نقل الشبكة إلى مربع المزجج الشبكة. كرر الخطوة 1.7. لإنتاج العدد المطلوب من الشبكات. عند الانتهاء ، وتشديد الخناق على غطاء المربع الشبكة (ق) ، ثم نقل بسرعة مربع (عناوين) نقل صغيرة ديوار النيتروجين السائل. 2. تحميل العينات في المجهر الالكتروني انتقال طوال هذا القسم ، ينبغي مراقبة مستوى السائل N 2 في حجرة التحميل بيقظة وسائل تجديد حسب الحاجة ، لضمان أن تبقى مغمورة مربعات الشبكة. قبل ان يصل الى وسيلة الاتصال مع الشبكة ، وتبريده بواسطة غمر في السائل N 2 حتى equilibrates مع السائل. بعد كل استخدام ، ينبغي مطلق الأدوات باستخدام بندقية الهواء الساخن. طوال هذا القسم يتم استخدام Tecnai الاتحاد الدولي للفروسية G2 Polara المجهر الالكتروني انتقال (تيم) بالاشتراكمع محطة كرو غاتان. في حين أن مبدأ تحميل عينات السائل تحت ظروف N 2 هي التي تنطبق على جميع الأعمال المجهري البرد الإلكترون ، وخطوات هذا المقطع هي محددة في المعدات المستخدمة في التجربة. سوف الخطوات المستخدمة لمعدات مختلفة تختلف باختلاف الشركة المصنعة. تنبيه : خلال هذا القسم ، وارتداء النظارات الواقية دائما عند التعامل مع الملابس والسائل N 2. ضمان Compustage TEM لا تحتوي على خرطوشة العينة ، وهذا اختيار العينة قضيب وقضيب الإدراج تقل 110 ك. باردة وتعد محطة كرو لتحميل شبكات التخزين في كتلة العينة ، التي هي جزء من العينة قضيب التحديد. نقل تبريد قضبان اختيار (<110 K) من المجهر لمحطة كرو. اختيار الشريحة قضيب قدما إلى إدراج كتلة التحديد إلى حمام النيتروجين على محطة كرو. إزالة كافة خراطيش عينة من كتلة التخزين باستخدام المتخصصة جartridge معالجة ملقط. مكان مربع الشبكة (الخانات) في محطة التحميل وتخفيف الغطاء (s) مع مفك البراغي. استخدام الملقط لإزالة الشبكة من الشبكة ومكان مربع في خرطوشة. استخدام أداة متخصصة التنسيب C – مقطع إلى إيداع C – مقطع على رأس الشبكة ، وتأمين الشبكة في خرطوشة. كرر الخطوة 2.5. حتى العدد المرغوب فيه من الشبكات في الخراطيش. نقل الخراطيش لعرقلة اختيار العينة. إعداد كرو محطة لإزالة قضيب اختيار العينة. قضيب اختيار الشريحة مرة أخرى إلى إزالة التحديد من كتلة الحمام النيتروجين. إزالة قضيب التحديد من محطة كرو ونعلق على TEM. 3. الحصول على بيانات المجهري البرد الإلكترون خلال هذا القسم ، يتم استخدام برنامج الاتحاد الدولي للفروسية التصوير المقطعي دفعة واجهة لإعداد ملف دفعي الذي يخزن إحداثيات جميع المواقع شبكة من المصالح. عندما كلف من قبل المستخدم ، يقوم البرنامج التصوير المقطعي الدفعية إعادة النظر في كل المواقف وتنسيق سوفإمالة اقتناء صورة مجهرية عبر سلسلة الرقمية. إذا كان هذا البرنامج غير متاح ، وحزمة برامج Leginon قابلة للحياة الحرة والمفتوحة المصدر البديلة 13. تم التصوير في 200 كيلو ، وذلك باستخدام التصوير غاتان تصفية (GIF) مع آخر X – GIF 2K كاميرا CCD 2K (غاتان). موقف Compustage مثل شعاع الالكترون الذي يمر عبر الفراغ. التبديل إلى وضع التكبير العالية التعرض (34kX) وأداء التحالفات المباشرة. محاذاة صفر ذروة الخسارة على تصفية الطاقة. (وهذا يوفر للمرشح في مجال الطاقة مع مرجع للإلكترونات مع فقدان الطاقة صفر). نقل Compustage إلى منطقة تتميز شبكة الكربون. في التكبير المنخفض (4.5kX) طريقة البحث ، استخدم الدالة المتذبذب لإمالة المرحلة ذهابا وإيابا بين + / -15 درجة. وفي الوقت نفسه ضبط الموقف المرحلة Z – المحور حتى يتم احترام الحد الأدنى من التحول المرحلة. (هذا المواقف المرحلة تقريبا على ارتفاع eucentric). تعطيل المتذبذب عندما يلاحظ أي تحول المرحلة. استخدام الآلي و الارتفاع Eucentric مرهم لصقل ارتفاع eucentric. (يستخدم هذا الروتين عبر الارتباط للحصول على ارتفاع أكثر دقة مما كان عليه في الخطوة eucentric 3.3). يتم تخزين الارتفاع Eucentric تلقائيا للرجوع اليها في وقت لاحق من قبل البرامج الدفعية التصوير المقطعي. العثور على مجال اهتمام يضم حوالي 3-6 virions ، وليس أقل من عشر علامات إيمانية. إضافة إلى الشبكة هذا الموقف دفعة ملف التصوير المقطعي. كرر الخطوات من 3.4. و 3.5. حتى يتم تعيين العدد المطلوب من المواقف. تعريف المعلمات الدفعي (± 60 درجة مع 2 بزيادات الميل ° ، 1-2 الإلكترونية / أ / 2 عرض الميل) وتشغيل دفعة واحدة. 4. إعادة إعمار البرد الإلكترون tomograms محاذاة سلسلة الميل التلقائي باستخدام إيمانية مقرها في محاذاة RAPTOR 1. إعادة tomograms باستخدام R – المرجح الإسقاط مرة أخرى في IMOD 8. تنسيق الملف القياسي لحجم البيانات الناتجة هو ملف MRC ، مع ملحق الملف. MRC. ve_title "> 5. التموج بتجزئة subvolumes الفيريون وتحديد يستخدم هذا القسم ملحق مخصص من IMOD التي تسمح للمستخدم لتعيين subvolumes الفيريون داخل صورة مقطعية. في القسم 6 ، يتم استخدام المستخدم تعريف حدود الفيريون وعلى طول السطح التي يتم اختيارها تلقائيا المسامير. فتح IMOD وتحميل صورة مقطعية مع virions بالسكان. انتقل على طول محور Z – من صورة مقطعية حتى يقع شريحة المركزية من خلال واحدة من virions. تحقق من أنه تم تحديد النقطه الوسطى الفيريون. بعد ذلك ، وإيداع علامة الفيريون. وسيتم استخدام هذه العلامة من قبل الأداة المساعدة الفيريون تجزئة الآلي في القسم 6. مواصلة تعيين النقطه الوسطى حتى يتم تحديد كافة وحدات التخزين الفيريون. إغلاق صورة مقطعية وحفظ مجموعة علامة تعريف centroids الفيريون. كرر حتى تم تعيينها في جميع virions tomograms. IMOD به ، subtomograms الفيريون أسفل عينة بمعامل أربع. virions Denoise به من الحافة تعزيز انتشار متباين كما نفذت في IMOD. تخضع لتجزئة virions غشاء غير خاضعة للرقابة باستخدام الطاقة المستندة إلى نهج ثلاثي الأبعاد (المفصل في Bartesaghi وآخرون 2005) 3. ويتم تحديد طفرات في مواقع على أسطح الفيريون مجزأة المقابلة لماكسيما المحلية عبر الارتباط بين موقع معين وارتفاع حجم متماثل الاصطناعية الشبيهة. وتضاف هذه المواقع المذكورة أعلاه عتبة المحدد إلى قائمة إحداثيات subvolumes ارتفاع المفترضة. 6. وبلغ متوسط تصنيف الجسيمات استخراج حسابي في subvolumes صورة مقطعية (100 × 100 × 100 voxels) في كل موقع من المواقع التي تم تحديدها في الخطوة 5.8. (يتم ذلك دون تقليل الضوضاء أو binning). المجموعة الناتجة من subvolumes تحتوي على بروتينات السنبلة التي سيتم تصنيفها وبلغ متوسط في الخطوات التالية. Determine توجهات المحور طويلة من الارتفاع باستخدام طبيعية لغشاء مقسمة تلقائيا في كل مكان من الارتفاع. هذا النهج يتيح التقديرات الأولية لاثنين من زوايا أويلر الثلاثة. عشوائية المتبقية في نفس المكان لمنع التناوب أي تحيز محتمل في التحالفات اللاحقة. تطبيق زوايا أويلر إلى subvolumes ، ثم محاذاة translationally في subvolumes إلى متوسط على الصعيد العالمي بلغ متوسط cylindrically للتأكد من أنهم يشتركون جميعا في نفس المركز للكتلة. إزالة 10 ٪ من subvolumes التي ترتبط معظم سيئة مع المتوسط العالمي المحدثة. يتم ذلك لإزالة الكثافة في أعظم خطر التعرف عن طريق الخطأ المسامير. ضبط وتصنيف وحدات التخزين ارتفاع دون استخدام المراجع الخارجية ومع محاسبية سليمة للإسفين مفقودة (المفصل في Bartesaghi آخرون 2008) 4. صقل تدريجيا subvolume الاصطفافات وتصنيف وحدات التخزين ارتفاع في كل التكرار. وينبغي ثلاثة أضعاف التناظر وحظ بوضوح في المراحل الأولى من التصنيف ، وعند التكرار الرابع ، يتم فرض التماثل 3 أضعاف. في كل جولة ، وبلغ متوسط معظم فئات محددة جيدا وتستخدم كمرجع للجولة القادمة. وينبغي عادة يتم اختيار ~ 4000 التموج لكل البيانات. ويتم الحصول على خرائط الكثافة النهائية بعد جولات ~ صقل 12/05 ، وسوف تشمل مساهمات من 50 ٪ ~ من وحدات التخزين الفرعية في كل البيانات. 7. التنسيق المناسب يتم فتح خرائط الكثافة الناتجة من 6.8 في 12 خطوة UCSF الوهم. إنتاج محاكاة 20 خريطة للأشعة السينية باستخدام إحداثيات الوهم أو إيمان 10. في قفص الاتهام إحداثيات التوجهات العشوائية. الوهم الذي بني به في أشد – صعود الأمثل المحلية ، تناسب إحداثيات عن طريق أداء مضاعفات 100 خطوات أشد الصعود حتى يتم الحصول على التقارب. 8. ممثل النتائج 3D باستخدام المتوسط والمناسب تنسيق ، ومجموعة متنوعة من فيروس نقص المناعة البشرية وفيروس نقص المناعة القردي ارتفاع هياكل بيئية قد تم حلها. قدمت في الشكل 3A هو هيكل الارتفاع مغلف من سلالة HIV – 1 ، بال (اللون الأرجواني). الارتفاع ثلاثة أضعاف التناظر مع أبعاد 120 ~ مقاسا من غشاء لقمة السنبلة ، وعرض القصوى ل150 ~ التي التناقص التدريجي لتصل إلى 35 ~ في قاعدة الارتفاع. كنا كما رأينا في الشكل 3B ، من خلال الجمع بين الكثافة خريطة بيئية لتحديد مثلوثي باستخدام البرد الإلكترون التصوير المقطعي مع هيكل مصمم لcrystallographically موحودي gp120 (أحمر ، والمستمدة من معرف PDB ، 2NY7) ، قادرا على الحصول على نموذج للعمل الجزيئية لل مثلوثي معقدة الظرف بروتين سكري (PDB الهوية ، 3DNN) 9. نهجنا يسمح أيضا لتحليل الهيكلية للمجمعات التي تشكلت بين مثلوثي بيئية ومجموعة متنوعة من البروتين gp120 محددةالشظايا والأجسام المضادة. ويرد مثال على هذا ، الذي هو المعقد بيئية مع فاب B12 تحييد على نطاق واسع في الشكل 4A (يظهر المجمع بأكمله في اللون الأرجواني). في هذا الشكل ، وتعتبر كثافة اضافية المقابلة لإسقاط B12 الخارج من السنبلة ، وموازية للغشاء. ويمكن تمديد التفسيرات البنيوية هذه المجمعات على المستوى الجزيئي التي تركيب خرائط الكثافة مع إحداثيات الذرية لأجزاء من السنبلة ، منضما إلى يجند المقابلة. يمكن أن ينظر إليها على أنها في الشكل 4B ، عندما يتم تركيب هذه الخريطة مع إحداثيات كثافة البروتين ارتفاع gp120 (أحمر ، والمستمدة من معرف PDB ، 2NY7) ملزمة فاب B12 (أبيض) ، والتوجهات النسبية للالقلوب الثلاثة gp120 يمكن تمييزها (PDB الهوية ، 3DNL). متعلق بتكوين هذه العلاقات هي مفيدة لفهم كيفية تفاعل هذه يغاندس مع تصاعد وتتداخل مع نشاط الفيروس. قدم بعض الهياكل الأخرى بيئية unliganded liganded والتي تم حلها بواسطة الأسلوب هنا متضمنةأودي تلك HIV – 1 R3A ، SIV CP – MAC ، وSIVmneE11S SIVmac239 ، مجمع ثلاثي بين HIV – 1 بيئية بال ، وفاب sCD4 17b ، وفيروس نقص المناعة القردي بيئية CP – ماك المعقد للأجسام المضادة 7D3 9،14. الشكل 1 من التعليق الفيروسية لهيكل 3D : الخطوات المفاهيمية في البرد المجهر الإلكتروني وإعادة الإعمار 3D. الشكل 2 (أ) ممثل من شريحة مقطعية من HIV – 1 virions. (ب) واحد HIV – 1 الفيريون ، مع ارتفاع الأساسية وتخطيطي يظهر السطح. الشكل 3 : (أ) ثلاثي الأبعاد هيكل بروتين سكري مغلف بال HIV – 1 (المسامير السطح) كما هو معروض على سطح غشاء الفيروس. (ب) نموذج الجزيئي للtrimeالتموج ريك يحددها وضع ثلاث نسخ من الهياكل اللازمة لموحودي gp120 (الحمراء) التي يجنيها البلورات بالأشعة السينية في خريطة كثافة 9. الشكل 4 : (أ) ثلاثي الأبعاد هيكل HIV – 1 مغلف بال بروتين سكري في مجمع مع فاب جزء من تحييد الأجسام المضادة على نطاق واسع ، B12. (ب) نموذج الجزيئي للمجمع التي يحددها وضع ثلاث نسخ من الهياكل المعقدة لموحودي فاب gp120 – B12 التي يجنيها البلورات بالأشعة السينية في خريطة كثافة 9.
Discussion
قدم المجهري البرد الإلكترون وتصنيف ثلاثي الأبعاد وأساليب المتوسط هنا تسمح لتحديد هياكل ثلاثية الأبعاد للبروتين سكري المجمعات المغلف ~ القرار ألف 20. تركيب الأشعة السينية إحداثيات مكونات موحودي للخرائط كثافة يسمح للتفسير هيكلية على المستوى الجزيئي. التحسينات المستمرة في المعدات الحاسوبية ذات التكلفة المنخفضة مجتمعة مع التطورات في الأدوات مفتوحة المصدر العلمية وانتشار البنية التحتية للشبكة لا يمكن تصورها سابقا جعل المساعي الممكنة العلمية التعاونية. علينا أن نستفيد من هذه التطورات ، وإظهار أنه يمكن جلب التقنيات العلمية المتطورة في متناول الطلاب من أعمار كثيرة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر قسم المنتجات البيولوجية لمرض الإيدز والسرطان برنامج الفيروسات ، فريدريك المتطورة ، وشركة ، لتقديم المنقى ، AT – 2 علاج الفيروسات HIV – 1 ، فلليني ستيفن وزملاؤه للحصول على المساعدة مع استخدام قدرات عالية الأداء الحسابية للBiowulf لينكس الكتلة في المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، دكتوراه في الطب (http://biowulf.nih.gov) ، الاتحاد الدولي للفروسية الشركة للحصول على المساعدة مع المجهر الإلكتروني ، وتايلر إيثان لمساعدة الخبراء وأرقام. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من مركز ابحاث السرطان في المعهد القومي للسرطان والمعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، ميريلاند.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil | – | 200 mesh |
| Protein A gold colloid | University of Utrech – The Netherlands | – | 10 nm diameter |
| HIV-1 BaL | NIH, NCI, Frederick, MD | – | ~ 1011 virions/mL |
| Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
| Vitrobot Mark III | FEI | – | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
| Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | – | 200 keV |
| Gatan Imaging Filter | Gatan | – | – |
| Gatan Post-GIF CCD | Gatan | – | 2K x 2K pixels |
| Gatan Cryo Workstation | Gatan | – | – |
| Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | – | Oxygen and Hydrogen plasmas |
| C – clips | FEI | ZIT0634 | – |
| Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | – | http://biowulf.nih.gov/ |
| UCSF Chimera | University of California – San Francisco | – | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
| IMOD | University of Colorado – Boulder | – | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
| EMAN | Baylor College of Medicine | – | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
| RAPTOR | Stanford University | – | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |
References
- Amat, F. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).
- Bowen, D. L., Lane, H. C., Fauci, A. S. Immunopathogenesis of the acquired immunodeficiency syndrome. Ann. Intern. Med. 103, 704-709 (1985).
- Bartesaghi, A., Sapiro, G., Subramaniam, S. An Energy-Based Three-Dimensional Segmentation Approach for the Quantitative Interpretation of Electron Tomograms. IEEE. T. Image. Process. 14, 1314-1323 (2005).
- Bartesaghi, A. Classification and 3D averaging with missing wedge correction in biological electron tomography. J. Struct. Biol. 162, 437-450 (2008).
- Harris, A. Trimeric HIV-1 gp140 immunogens and native HIV-1 envelope glycoproteins display the same closed and open quaternary molecular architectures. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11440-11445 (2011).
- Harris, R. J., Adrian, M. Preparation of thin-film frozen-hydrated/vitrified biological specimens for cryoelectron microscopy. Methods Mol. Biol. 117, 31-48 (1999).
- Iancu, C. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1, 2813-2819 (2006).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. J. Struct. Biol. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data using IMOD. 116, 71-76 (1996).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455, 109-113 (2008).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: Semiautomated Software for High-Resolution Single-Particle Reconstructions. J. Struct. Biol. 128, 82-97 (1999).
- Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Cryo-electron tomography of bacteria: progress, challenges and future prospects. Nat. Rev. Microbiol. 7, 666-675 (2009).
- Pettersen, E. F. UCSF Chimera – A Visualization System for Exploratory Research and Analysis. J. Comput. Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Suloway, C. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J. Struct. Biol. 151, 41-60 (2005).
- White, T. Molecular architectures of trimeric SIV and HIV-1 envelope glycoproteins on intact viruses: strain-dependent variation in quaternary structure. PLoS. Pathog. 6, e1001249-e1001249 (2010).
Tags
HIVMolecular StructuresCryo-Electron TomographyAutomated Sub-tomogram AveragingHIV Envelope GlycoproteinsCD4+ T-cellsImmune SystemAcquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS)Spike ProteinCD4 ReceptorCo-receptorProtein InteractionsHIV Infection PathwayHIV ResearchHIV VaccineCryo-electron Tomography3D Image ProcessingViral Membrane Proteins
Cite This Article
Meyerson, J. R., White, T. A., Bliss, D., Moran, A., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., de la Cruz, M. J. V., Schauder, D., Hartnell, L. M., Nandwani, R., Dawood, M., Kim, B., Kim, J. H., Sununu, J., Yang, L., Bhatia, S., Subramaniam, C., Hurt, D. E., Gaudreault, L., Subramaniam, S. Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770, doi:10.3791/2770 (2011).