Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

De aanpak die hier wordt beschreven is ontwikkeld met behulp van een specifieke set van instrumenten, tools en software. Omdat alle labo's niet gebruikt dezelfde experimentele opstelling, werd poging gedaan om de aanpak generaliseren waar mogelijk, en de alternatieven waar dit niet mogelijk was te geven. 1. Voorbereiden verglaasde virusmonsters In de volgende paragraaf verglaasde netten zijn bereid met behulp van de FEI Vitrobot Mark III, een blotting en duik invriezen robot. Zie Iancu, et al.. Voor een gedetailleerd protocol over het gebruik van dit systeem 7. Als alternatief voor een robot zuiger, een guillotine-stijl of de zwaartekracht zuiger is perfect voldoende 6. In de artikelen 1.2. en 1.3. een Gatan Solarus 950 glimontlading eenheid wordt gebruikt voor het monster grids reinigen en hun hydrofiliciteit te verhogen, hoewel elk glimontlading toestel dat ontworpen is voor gebruik met elektronen microscopie roosters kan worden vervangen. content "> Hoewel de hoeveelheid monster volume toegepast op de grid voor blotting en duik invriezen moet worden in het bereik van 2 pl, zal het virus en eiwit-A goud colloïdaal volume in de steekproef mengsel variëren, afhankelijk van de bron. Als zodanig, is het waarschijnlijk dat een aantal van het virus en goud verdunningen of ratio's zal moeten worden getest en afgebeeld in de microscoop, en een ideale mix empirisch bepaald. Merk op dat wanneer de opname van gegevens wordt verkregen in hoofdstuk 3, tussen de 10 en 20 gold de vaste markeringen moeten aanwezig zijn voor een goede tilt serie uitlijning. Let op: Dit hoofdstuk beschrijft het gebruik van gasvormige ethaan, waterstof en zuurstof, die zijn licht ontvlambaar. De juiste voorzichtigheid is geboden bij het gebruik van deze gassen. Bovendien moet erop worden gelet dat virus monsters behandelen in overeenstemming met bioveiligheid aanbevelingen. Tot slot, altijd beschermende brillen en kleding bij het ​​hanteren van vloeibare stikstof (N 2) en ethaan. Bereid FEI Vitrobot MarkIII door het inschakelen van de N 2 gas leveren, het installeren van de luchtbevochtiger cartridge en vervolgens vullen van de cartridge met gefilterd gedeïoniseerd water. Power on Vitrobot en de klimaatkamer temperatuur van 22 ° C instellen, doel luchtvochtigheid tot 100%, blotting tijd tot 6 sec, en blot offset tot -2 mm. Macht op de Gatan Solarus 950 glimontlading unit en open H 2 en O 2 blikken dat het toestel leveren. Pre-clean exemplaar kamer door het uitvoeren van gloei-ontlading voor een min bij 50 Watt. Schik het gewenste aantal essen koolstof roosters op een glazen dekglaasje, koolstof kant naar boven, en plaats binnen glimontlading exemplaar kamer door de bovenlader deur. Schone roosters door het uitvoeren van gloei-ontlading voor 6-10 sec bij 25 Watt. (Merk op dat de koolstof-kant van de Quantifoil merk rasters die in dit protocol zijn mat van uiterlijk. Dit zal niet waar zijn voor alle commerciële netten dus het is best om deze informatie te verkrijgen van de fabrikant.) Plaats rooster vakje (s) in cooLant container kom, en thermische diffuser as op het centrale beker die zit in de koelvloeistof kom. Giet langzaam vloeibaar N 2 in de kom tot krachtige borrelen afneemt, wat aangeeft het evenwicht tussen de kom en vloeistof. Onderhouden vloeibare N 2-niveau gedurende de rest van de procedure, waarbij zorg voor het houden van de centrale beker. Bevestig een uiteinde van een plastic slang aan op de ethaan gas bus, en het andere uiteinde op een glazen pipet. Houd de glazen pipet tip naar onderkant van centrale cup heeft, een langzame, gestage stroom ethaan, ethaan en begint condensatie. Ga door totdat het vullen van de centrale beker vol is. Verwijder de as van het centrum van beker. Bereid monster mengsel door het toevoegen van 2 pi proteïne-A goud colloïde de vaste tot 10 pi AT-2 geïnactiveerd HIV-1 virus schorsing. Voorzichtig pipet mengsel fiducials te brengen in de oplossing. Te houden op het ijs. Pak de buitenste rand van een rooster met de gespecialiseerde Vitrobot pincet. Breng 2 pi van het monster mengsel van koolstof side van grid. Onmiddellijk aan robot om te proeven laden in vochtige klimaatkamer, blot en duik vriezen in vloeibare ethaan. Overdracht verglaasd rooster op raster box. Herhaal stap 1.7. om het gewenste aantal roosters te produceren. Wanneer u klaar bent, draai de schroeven op de rooster deksel (s), dan snel overbrengen vakje (s) om kleine vloeibare stikstof transport Dewar. 2. Het laden van monsters in transmissie-elektronenmicroscoop In dit gedeelte, moet de vloeistof N 2-niveau in de laadruimte daarom goed gecontroleerd worden, en vloeibare aangevuld als nodig is, om ervoor te zorgen dat het net dozen blijven ondergedompeld. Alvorens een instrument in contact met een rooster, koel door het onder te dompelen in vloeibare N 2 totdat het evenwicht houdt met de vloeistof. Na elk gebruik moet gereedschap worden ontdooid met behulp van een hete lucht pistool. In dit gedeelte van de FEI Tecnai G2 Polara transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) wordt gebruikt in combinatiemet een Gatan Cryo Workstation. Hoewel het principe van de laad-monsters onder vloeibare N 2 voorwaarden is van toepassing op alle cryo-elektronenmicroscopie werk, de stappen van deze sectie zijn specifiek voor de apparatuur die wordt gebruikt in het experiment. De stappen worden gebruikt voor andere apparatuur zal verschillen per fabrikant. LET OP: In deze sectie, altijd beschermende brillen en kleding bij het ​​hanteren van vloeibare N 2. Zorg ervoor dat de TEM Compustage niet een exemplaar cartridge bevat, en dat het monster selectie stang en het inbrengen staaf zijn hieronder 110 K. Cool en voor te bereiden Cryo Workstation voor het laden te zetten in exemplaren opslag blok, dat deel uitmaakt van de steekproef selectie staaf. Breng de afgekoelde (<110 K) selectie stang van microscoop naar Cryo Workstation. Schuif selectie staaf uit naar keuze af te lezen in stikstof bad op Cryo Workstation. Verwijder alle exemplaren cartridges uit de opslag te blokkeren met behulp van gespecialiseerde cartridge-handling tang. Plaats rooster vakje (s) bij het laden werkplek en los deksel (s) met een schroevendraaier. Gebruik een pincet om het net te verwijderen uit het net doos en plaats in de cartridge. Gebruik de gespecialiseerde C-clip plaatsing hulpmiddel om een ​​C-clip storten op de top van het net, beveiligen rooster in een patroon. Herhaal stap 2.5. totdat het gewenste aantal roosters zijn in patronen. Overdracht cartridges exemplaar selectie te blokkeren. Bereid Cryo Workstation voor het verwijderen van het monster selectie staaf. Schuif selectie staaf om de selectie te blokkeren verwijderen van stikstof bad. Verwijder de selectie staaf uit Cryo Workstation en bevestig deze aan TEM. 3. Het verwerven van cryo-elektronenmicroscopie gegevens Tijdens dit gedeelte wordt de FEI Batch Tomografie software-interface gebruikt voor het opzetten van een batch-bestand dat de coördinaten van alle netbeheerders posities van belang winkels. Als opdracht van de gebruiker, zal de Batch Tomografie software opnieuw elk van de posities en zal coördinerentilt serie overname via Digital microfoto. Als deze software niet beschikbaar is, de Leginon softwarepakket is levensvatbaar gratis, open source-alternatief 13. Imaging werd gedaan op 200 keV, met behulp van een Gatan Imaging Filter (GIF) met een post-GIF-2K x 2K CCD-camera (Gatan). Positie Compustage zodanig dat elektronenbundel passeert vacuüm. Schakel over naar een sterke vergroting (34kX) belichtingsstand en het uitvoeren van directe uitlijning. Lijn nul verlies piek op energie-filter. (Dit levert de energie filter met een referentie voor elektronen met nul-energie verlies.) Verplaats de Compustage om een ​​raster gebied met koolstof. Bij lage vergroting (4.5kX) Search Mode, gebruikt u de Wobbler functie om het podium heen en weer kantelen tussen de + / -15 °. Ondertussen passen de Z-as fase positie tot minimaal het podium verschuiving wordt waargenomen. (Dit posities het podium ongeveer op eucentrische hoogte). Schakel Wobbler als er geen podium verschuiving wordt waargenomen. Gebruik de automatische eucentrische Hoogte f zalving van de eucentrische hoogte te verfijnen. (Deze routine maakt gebruik van kruiscorrelatie te komen tot een meer accurate eucentrische hoogte dan in stap 3.3). Eucentrische hoogte wordt automatisch opgeslagen voor latere referentie door Batch Tomografie software. Zoek een gebied van belang met ongeveer drie tot zes virionen, en niet minder dan tien de vaste markers. Voeg dit raster positie om de batch-tomografie-bestand. Herhaal stap 3.4. en 3.5. totdat het gewenste aantal posities worden aangewezen. Definieer batch parameters (± 60 ° met 2 ° tilt stappen, 1-2 e-/ A 2 / tilt view) en voer het batch. 4. Reconstructie cryo-elektron tomograms Lijn tilt-serie met automatische de vaste basis van de aanpassing van RAPTOR 1. Reconstrueren tomograms met R-gewogen terug projectie in IMOD 8. Het standaard bestandsformaat voor de resulterende data volumes is het MRC-bestand, met extensie. MRC. ve_title "> 5. segmenteren virion subvolumes en het identificeren van spikes Dit gedeelte maakt gebruik van een aangepaste uitbreiding van IMOD waarmee de gebruiker virion subvolumes wijzen binnen de tomogram. In paragraaf 6 worden de door de gebruiker gedefinieerde virion grenzen gebruikt worden als een oppervlak waarlangs spikes automatisch worden geselecteerd. Open IMOD en laad een tomogram bevolkt met virionen. Navigeren langs de Z-as van de tomogram tot de centrale slice door een van de virions zich bevindt. Controleer of de virion zwaartepunt is geïdentificeerd. Na dit te doen, stort een virion marker. Deze markering zal worden gebruikt door de geautomatiseerde virion segmentatie nut in hoofdstuk 6. Ga verder zwaartepunt benoeming tot alle virion volumes worden geïdentificeerd. Sluit tomogram en op te slaan markering in te stellen het definiëren van virion centroïden. Herhaal dit tot virionen zijn aangewezen in alle tomograms. Met behulp van IMOD, down-sample virion subtomograms met een factor vier. Denoise virionen gebruik van edge-verhogende anisotrope diffusie zoals uitgevoerd in IMOD. Onder voorbehoud van virionen om zonder toezicht membraan segmentatie met behulp van een energie-op basis van drie-dimensionale benadering (uitgewerkt in Bartesaghi et al.. 2005) 3. Spikes worden geïdentificeerd op locaties op de gesegmenteerde virion oppervlakken die overeenkomt met de lokale maxima van cross correlatie tussen de bijzondere ligging en een synthetische symmetrische piek-als volume. Die locaties boven een bepaalde drempel worden toegevoegd aan een lijst van coördinaten voor vermeende spike subvolumes. 6. Classificeren en het gemiddelde van de deeltjes Computationeel extract van de tomogram subvolumes (100 x 100 x 100 voxels) op elke locatie die werd geïdentificeerd in stap 5.8. (Dit wordt gedaan zonder denoising of binning). De resulterende verzameling van subvolumes bevatten de spike eiwitten die zullen worden ingedeeld en gemiddeld in de volgende stappen. Determine de oriëntaties van de lange as van de piek met behulp van de normaal op de automatisch gesegmenteerde membraan op de locatie van elke spike. Deze aanpak biedt de eerste ramingen voor twee van de drie Euler hoeken. Randomize de overige in-place draaien om eventuele bias in latere aanpassingen te voorkomen. Van toepassing Euler hoeken subvolumes, dan translationeel lijn de subvolumes om hun cilindrisch gemiddelde mondiale gemiddelde te zorgen dat ze allemaal hetzelfde centrum van de massa. Verwijder de 10% van subvolumes dat de meeste slecht correleren met de bijgewerkte mondiale gemiddelde. Dit wordt gedaan om dichtheden te verwijderen het grootste risico te worden ten onrechte geïdentificeerd spikes. Uitlijnen en classificeren piek volumes zonder het gebruik van externe referenties en met de juiste boekhouding van de ontbrekende wig (beschreven in Bartesaghi et al.. 2008) 4. Geleidelijk te verfijnen subvolume uitlijningen en classificeren piek volumes bij elke iteratie. Drie-voudige symmetrie moet duidelijk worden waargenomen in de vroege stadia van de indeling, en bij de vierde iteratie, 3-voudige symmetrie is opgelegd. Bij elke ronde worden de meest gedefinieerde klassen gemiddeld en worden gebruikt als referentie voor de volgende ronde. Typisch ~ 4000 spikes moeten worden geselecteerd voor elke dataset. Einddichtheid kaarten zijn verkregen na ~ 5-12 verfijning rondes en omvat bijdragen van ~ 50% van de sub-volumes in elke dataset. 7. Coördineren van montage De dichtheid kaarten als gevolg van stap 6.8 worden geopend in UCSF Chimera 12. Maak een gesimuleerde 20 een kaart van de X-ray coördinaten met behulp van Chimera of EMAN 10. Dock coördinaten in willekeurige oriëntaties. Met behulp van Chimera's ingebouwde steilste klim-lokale optimalisatie, fit coördinaten door het uitvoeren van een veelvoud van 100 steilste klim stappen tot convergentie wordt verkregen. 8. Representatieve resultaten Met behulp van 3D-gemiddelde en het coördineren van montage, een variëteit van HIV en SIV Env spike structuren zijn opgelost. In Figuur 3A is de structuur van de Envelope piek van de HIV-1 stam, Bal (paars). De piek heeft drie-voudige symmetrie met een afmeting van 120 ~ Å, gemeten vanaf de membraan naar de spike apex, en een maximale breedte van ~ 150 A, die naar beneden taps toeloopt tot ~ 35 Å aan de basis van de piek. Zoals te zien in figuur 3B, door het combineren van de dichtheid kaart voor trimere Env bepaald met behulp van cryo-electron tomografie met de kristallografisch vastgestelde structuur voor monomere gp120 (rood, afgeleid van het VOB ID, 2NY7), konden we een werkende moleculaire model voor het verkrijgen van trimere enveloppe glycoproteïne complex (VOB ID, 3DNN) 9. Onze aanpak maakt het ook voor de structurele analyse van de complexen gevormd tussen trimere Env en een verscheidenheid aan gp120-specifieke eiwitfragmenten en antilichamen. Een voorbeeld hiervan, waarbij env is gecomplexeerd met de breed neutraliserende Fab B12 is weergegeven in figuur 4A (het gehele complex is te zien in paars). In deze figuur is de extra dichtheid die overeenkomt met b12 gezien projecteren naar buiten vanuit de piek, en parallel aan het membraan. Structurele interpretaties van dergelijke complexen kan worden uitgebreid tot het moleculaire niveau door de montage van de dichtheid van kaarten met atomaire coördinaten voor delen van de spike, gebonden aan de overeenkomstige ligand. Zoals te zien in figuur 4B, wanneer deze dichtheid kaart is uitgerust met de coördinaten van de gp120 spike eiwit (rood, afgeleid van het VOB ID, 2NY7), gebonden aan B12 Fab (wit), de relatieve oriëntaties van de drie gp120 kernen kunnen worden onderscheiden (VOB ID, 3DNL). Deze conformationele relaties zijn leerzaam om te begrijpen hoe dergelijke liganden interactie met de spike en interfereren met virusactiviteit. Enkele andere structuren van unliganded en liganded Env die zijn opgelost door de methode hier gepresenteerde incl.Ude die van HIV-1 R3A, SIV CP-MAC, SIVmneE11S en SIVmac239, de ternaire complex tussen HIV-1 Env Bal, sCD4 en de 17b Fab, en SIV CP-Mac Env gecomplexeerd aan de 7D3 antilichaam 9,14. Figuur 1 Van virale opschorting tot 3D-structuur:. Conceptuele stappen in cryo-elektronenmicroscopie en 3D-reconstructie. Figuur 2. (A) Een vertegenwoordiger van een slice tomogram van HIV-1 virionen. (B) een enkele HIV-1 virion, met de kern en het oppervlak spikes schematisch weergegeven. Figuur 3. (A) Drie-dimensionale structuur van het HIV-1 Bal Envelop glycoproteïne (oppervlakte spikes) zoals weergegeven op het oppervlak van de virale membraan. (B) Moleculaire model voor de Trimeric spikes bepaald door het plaatsen van drie exemplaren van de structuren voor monomere gp120 (rood) die door X-ray kristallografie in de dichtheid kaart 9. Figuur 4. (A) Drie-dimensionale structuur van HIV-1 Bal Envelop glycoproteïne in complex met het Fab-fragment van een breed neutraliserende antilichamen, b12. (B) Moleculaire model voor het complex wordt bepaald door het plaatsen van drie exemplaren van de structuren voor monomere gp120-B12 Fab complex afgeleid door X-ray kristallografie in de dichtheid kaart 9.