Multivirus特异性T细胞的生成，预防/治疗异基因造血干细胞移植后的病毒感染

1。直流nucleofection 收获单核细胞衍生的区议会，已使用塑料的坚持，培养5天使用的细胞Genix媒体与IL – 4（1000U/ml）补充，GMCSF（800IU/ml），并进一步为使用DC的成熟细胞因子IL – 4（1000U 24小时成熟丰富/毫升），GMCSF（800IU/ml），IL6100ng/ml，TNF -α在10ng/ml，IL1 -β在10ng/ml和PGE2（1μg/ml）1，温柔的再悬浮与3毫升移液管。 计数可行的区议会，使用，转移到3倍的15毫升管不下 0.5×10 6台盼蓝和不超过2 × 10 6细胞/管。 离心10分钟@200克区议会。在这段时间内预温细胞Genix媒体辅以DC成熟的细胞因子（DC成熟媒体） – 2ml/well 12井井组织处理板在37 ° C / 5％CO 2培养箱培养。 一旦细胞完成纺纱，吸出上清液，并添加相关的DNA质粒在终浓度为5μgDNA /管到每个管。在这种情况下，添加质粒IE1 – PP65管＃1，六邻体聚氯管＃2，EBNA1 – LMP2 – BZLF1管＃3。 悬浮区议会及与DNA的Amaxa nucloefection溶液100μL，拌匀，并转移到nucleofection试管。 4D nucleofector试管，选择方案CB150（Amaxa /龙沙），并按下启动。 nucleofection后立即添加2毫升预热细胞Genix DC成熟媒体试管500μL移液器向上和向下的2-3倍，并转移nucleofected区议会到准备好的12孔板包含剩余的1.5毫升的预热，轻轻混匀DC成熟的媒体。转移到37 ° C / 5％的CO 2培养箱中培养12 – 18小时进一步。 2。 T细胞的刺激 nucleofected区议会的收获和计数，并照射在30Gy。洗一次的CTL培养基用10ml（45％，45％的RPMI点击EHAA，10％FBS，2MM Glutamax）和重悬@ 3 × 10 5区议会每毫升的CTL媒体。 池最低7.5×10 5（2.5毫升）和15×10 5（5毫升）含有质粒的每个区议会的最大汇集区议会和传输设备将被放置在孵化器的G – REX。 对于响应者细胞的制备，使用或者原先被冻结的外周血单核细胞或单核细胞非贴壁后的DC选择（坚持或CD14的选择）保持。解冻的细胞，转移到预热的培养基，洗一次与CTL的媒体。重悬在CTL媒体细胞，细胞计数，并把他们带到浓度每毫升2 × 10 6细胞。以15×10 6细胞或7.5毫升和补充30000U IL – 4（1000U/ml -终浓度）和300ng IL7（在10ng/ml -终浓度）。 转移的PBMC7.5毫升（15×10 6个细胞）的G – REX和顶起来的生物反应器的30毫升总量的CTL媒体。 文化的G – REX为6-7天，37 ° C / 5％ 二氧化碳培养箱。 3。 T细胞扩张 6-7天，吸10毫升媒体，再拌入其余20毫升在媒体的细胞与一个10毫升吸管和使用台盼蓝活细胞计数。如果有<50×10 6补充新鲜媒体+因子。如果有> 50×10 6个细胞，取出细胞悬液10毫升，转移到一个新的G – REX，然后与新鲜的CTL媒体+细胞因子的两个G – Rexs饲料。 文化为4-6天。一旦足够的细胞已被扩大，执行的表型和功能特性以供将来使用CTL和冻存过剩。 4。代表性的成果： 美国FDA批准的multivirus特异性CTL生成过程的示意图如图1所示 。相比之下公约multivirus CTL协议，该协议使用adenovectors和EBV – LCL刺激病毒的反应性T 细胞 2我们已经取代传染性病毒DNA质粒材料编码由每个病毒3产生的多种抗原。为了刺激trivirus的CTL，我们设计了三个multicistronic质粒编码的腺病毒六邻体和聚氯，IE1和PP65 CMV和EBNA1，LMP2，和BZLF1 EB病毒。这些抗原被选择的基础上，鼓励我们自己和其他群体显示，T细胞针对ADV -六邻体和聚氯 2,4-6和CMV – 1E1和CMV – PP65 保护 体内 7临床效果。对于EB病毒，EBNA1是一个免疫优势的CD4 + T细胞在所有EBV相关的恶性肿瘤，在正常的EB病毒感染的B细胞表达的靶抗原8,9，LMP2是跨多个HLA类型在大多数EB病毒恶性肿瘤的免疫原性和表示，10,11，而BZLF1编码免疫优势，即早裂解周期的抗原刺激CD4 +和CD8 + T细胞和大多数个人的合作是可能的重要ntrol细胞复制病毒12。为了进一步优化我们的制造方法，我们生成的CTL刺激13,14 minimalized，无抗生素（FDA标准）质粒与自然科技合作。使用这一战略，我们坚持实现nucleofection效率> 35％，同时保持较高的细胞活力（数据未显示 ）3，图2显示了病毒特异性T细胞的频率响应优化IFNγELISPOT测定DNA质粒，更大的比pShuttle基于传统的表达质粒，表达相同抗原（N = 8腺病毒，N = 4 CMV和N = 2 EB病毒）。强有力的T细胞的刺激， 如在图3中，其中一个1:50的比例制作的次优激活到一个1:20 s相比所示：R比（N = 2的捐助者）的DC的最佳比例：外周血单个核细胞是重要的。生产足够广泛的抗原特异性CTL的数字是对所有三种病毒的临床疗效的先决条件。这是通过在G – REX，它支持出众的T细胞扩张相比与传统的24孔板（ 图 4A）15的CTL文化，而​​IL – 4和IL7除了增加文化的剧目和特异性如图4B所示反应性T细胞对巨细胞病毒- PP65衍生的HLA – A2的频率只供NLV肽进行了评估，存在或IL – 4和/或IL7 16,17的情况下产生的文化。为了扩大我们进行流式细胞仪分析细胞，细胞内细胞因子染色/γ干扰素ELISPOT，和最终产品的冷冻保存/输液铬51释放试验评估的表型和功能的能力。通常情况下，生成的细胞混合人口与CD4 +和CD8 + T细胞与抗原特异性两个T细胞车厢的检测多克隆。的CTL能够杀死病毒抗原表达的靶细胞，但不是病毒呈阴性反应的部分- HLA匹配的目标，这表明他们不应该诱导体内移植物抗宿主病（GVHD）（图5）。 图1。rCTL代协议。首先，区议会nucleofected与病毒抗原编码质粒，然后与自体外周血单个核细胞在一个R混合：小号10或20:1。在G – REX 10-14天的IL – 4和IL7存在，然后收获，计算，测试功能，身份和不育，然后供临床使用冻存的细胞扩大。 图2。优化的DNA 质粒在体外诱导优越的T细胞活化。区议会是nucleofected与优化，符合美国FDA的质粒编码六邻体和聚氯（ADV），IE1和PP65（CMV）和EBNA1，LMP2，和BZLF1（EB）或常规pShuttle质粒编码相同的抗原。这些都是用来刺激T细胞和特异性是由γ干扰素ELISPOT后10天刺激分析。 图3优化直流：CTL的激活T细胞的比率。 2捐助者的区议会nucleofected与所有三个优化质粒，然后用刺激自体外周血PBMC中的比例在1:20或1:50直流。激活的T细胞的频率γ干扰素ELISPOT 10天评估。 图4。使用增强因子的G – REX的T细胞扩增。 A组的G – REX设备以及外观透氧膜显微镜评估CTL。一个处理板VS的G – REX公约组织文化取得的细胞输出之间的比较也同时显示。 B组显示CMV的五聚体阳性的CTL在无细胞因子，IL – 4单独IL7单独和IL – 4 + IL7存在扩大文化方面取得的频率。 图5。扩大CTL的表型和功能 。 小组一显示了一个在扩大multivirus的CTL，CD4 +（45％ -辅助）的混合多克隆表型的代表性的例子和CD8 +（42％ -细胞毒性）T细胞，其中的大部分（95％ ）表示的内存标记CD45RO + / CD62L +。 小组乙表明，这些细胞是针对所有的刺激抗原，并是多官能为细胞内细胞因子染色评估检测生产的IFNγ和抗原刺激后肿瘤坏死因子。C组显示的扩大的CTL作为衡量功能CR 51检测。自体拼箱，单独或​​与空载体或腺病毒载体表达CMV – PP65转用于焦油获取。 Alloreactivity评估使用异体PHA的爆炸目标。