Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

1. DC nucleofection Hücre Genix IL4 (1000U/ml) ile desteklenmiş Medya, GMCSF (800IU/ml) ve DC olgunlaşma sitokinler IL4 (1000U kullanarak 24 saat için daha olgunlaşmış kullanarak 5 gün boyunca plastik bağlılık kültürü ile zenginleştirilmiştir Hasat monosit türevli DC'lerin, / ml), 3ml transfer pipet yardımıyla yumuşak tabanda GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10 ng, IL1-β 10 ng ve PGE2 (1μg/ml) 1,. Tripan mavi, en az 6 0.5×10 daha 3x 15ml tüp içine transferi ve daha 2×10 6 hücre / tüp kullanarak yaşayabilir DC'ler Sayısı. 10mins @ 200g DC'ler Santrifüj. Üç kuyu, 37 ° C / 5% CO 2 inkübatör plaka tedavi 12 iyi doku kültürü 2ml/well – Bu süre içinde ön-sıcak Hücre Genix medya DC olgunlaşma sitokinler (DC olgunlaşma medya) ile desteklenebilir . Hücreler bir kez iplik bitirdikten süpernatant aspirat ve 5μg DNA / tüp nihai bir konsantrasyon tüplerin her biri için ilgili DNA plazmid ekleyin. Bu durumda plazmid kodlama tüp IE1 pp65 # 1, tüp Hexon Penton # 2, ve tüp # 3 EBNA1-LMP2-BZLF1 ekleyin. Amaxa nucloefection çözüm 100μl ile yeniden süspanse DC'ler ve DNA, iyice karıştırın ve nucleofection küvetler transfer. 4D nucleofector Yeri küvetler, program CB150 (Amaxa / Lonza) seçin ve start tuşuna basın. Nucleofection küvet 2ml önceden ısıtılmış Hücre Genix DC olgunlaşma medya 500μl eklemek hemen sonra, prewarmed kalan 1.5 ml'lik hazırlanan 12 plaka için aşağı yukarı 2-3 kez ve transfer nucleofected DC'ler pipetleme ve hafifçe karıştırın DC olgunlaşma medya. 37 Transfer ° C /% 5 CO 2 inkübatör, bir başka 12-18hrs . 2. T hücre uyarımı Hasat ve 30Gy az nucleofected DC'ler sayımı, ve ışın tedavisi. CTL orta 10ml ile (% 45 RPMI,% 45 Tıklanma EHAA,% 10 FBS, 2mm Glutamax) ve CTL medya ml'de tekrar süspansiyon @ 3 x 10 5 DC'ler ile bir kez yıkayın . Havuz 7.5×10 5 (2.5ml) ve her içeren plazmid DC'ler 15×10 5 (5ml), maksimum ve minimum toplanmış DC'ler sonra kuvöz içinde yer alacak G-Rex cihaza aktarmak. Cevapçı hücrelerinin hazırlanması için önceden dondurulmuş PBMC'ler veya DC seçimi (yapışma veya CD14 seçimi) sonra kalan yapışmaz mononükleer hücreler ya kullanın. Hücrelerin çözülme, prewarmed kültür ortamına transfer CTL medya ile bir kez yıkayın. CTL Medya hücrelerinin yeniden süspanse hücre sayımı ve ml'de 2×10 6 hücre konsantrasyonu getirin. Ve 300ng IL7 (10 ng – son derişim) – 30000U IL4 (son kons 1000U/ml) ile 15×10 6 hücre veya 7.5ml ve ek çekin. PBMC 7.5ml (15×10 6 hücre), G-Rex ve medya ile toplam hacim 30ml bir CTL biyoreaktör kontör transferi . Kültür G-Rex 6-7 gün süreyle 37 ° C /% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör. 3. T hücre genişletme Günde 6-7, medya aspirat 10ml, 10ml pipet ile medya kalan 20ml hücrelerin karışımı ve tripan mavisi kullanarak canlı hücreleri saymak. Varsa <50×10 6 taze medya + sitokinler ile doldurmak. > 50×10 6 hücre varsa, hücre süspansiyonu 10ml kaldırmak, yeni bir G-Rex transferi, ve sonra taze CTL medya + sitokinler ile hem de G-Rexs beslemek . Kültür ek olarak 4-6 gün. Yeterli hücre ileride kullanmak üzere CTL ve cryopreserve fazla fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu gerçekleştirmek genişletilmiştir. 4. Temsilcisi Sonuçlar: FDA onaylı multivirus spesifik CTL nesil sürecinin şematik Şekil 1'de gösterildiği gibi, virüs-reaktif T hücreleri uyarmak için adenovectors ve EBV-LCL kongre multivirus CTL protokollerin aksine 2 DNA plazmid ile bulaşıcı bir virüs malzeme yerini almıştır 3 virüsleri her türetilen birden fazla antijene kodlamak. Biz üç multicistronic EBV plazmid kodlama Hexon ve Penton adenovirüs, IE1 ve pp65 CMV ve EBNA1, LMP2 ve BZLF1 trivirus CTL uyarmak için tasarlanmıştır. Bu antijenler, kendi ve T hücreleri İlan-hexon ve Penton 2,4-6 yöneltilmiş ve CMV-1E1 ve CMV pp65 in vivo 7 koruyucu gösteren diğer grupların klinik sonuçlar cesaret göre seçilmiştir. EBV, EBNA1 bir immünodominant CD4 + T hücre hedef antijen EBV ile ilişkili maligniteler ve EBV ile enfekte olan B hücreleri, normal ifade 8,9, LMP2 birden fazla HLA tipleri arasında immünojenik ve çoğu EBV maligniteler ifade 10,11 BZLF1 süre en bireyler hem CD4 + ve CD8 + T hücreleri uyarır ve işbirliği için büyük olasılıkla önemli olduğunu immünodominant, derhal erken litik döngüsü antijeni kodlayanvirüsü 12 kopyalayan hücreleri ntrol. Üretim yöntemleri daha da optimize etmek için CTL stimülasyon 13,14 minimalized, antibiyotik (FDA-uyumlu) plazmid oluşturulan Doğa Teknolojisi ile işbirliği yaptı. IFNγ ELISPOT ile ölçülen gibi optimize edilmiş DNA plazmid yanıt virüs spesifik T hücrelerinin sıklığı, daha fazla olduğunu, yüksek hücre canlılığı (veriler gösterilmemiştir) 3. Şekil 2 korurken, bu stratejiyi kullanarak sürekli olarak>% 35 nucleofection verimi sağlamak aynı antijenleri (n = 8 Adenovirüs, n = 4, CMV ve n = 2 EBV) ifade geleneksel pShuttle tabanlı ifade plazmid yanıt daha. DC optimal oranı: R oranı (n = 2 vericileri): hücre, Şekil 3'te 1:50 'lik bir oran 1:20 G göre sub-optimal aktivasyon görüldüğü gibi güçlü bir T hücre uyarılması için önemliydi . Üretim geniş antijen özgüllüğü yeterli CTL numaraları üç virüslere karşı klinik etkinliği için bir ön koşuldur. Bu, kültürleri artar IL4 ve IL7 ek olarak repertuar ve özgüllüğü ise Şekil 4B gösterilen, geleneksel 24-kuyucuğu (Şekil 4A) 15 ile karşılaştırıldığında üstün T hücre genişlemesini destekliyor G-Rex, CTL kültürü ile elde CMV pp65-türevli HLA-A2 karşı reaktif T hücrelerinin sıklığı resticted NLV peptid IL4 ve / veya IL7 16,17 varlığı ya da yokluğu oluşturulan kültürlerde değerlendirildi. Dondurulması / infüzyon için nihai ürün üzerindeki akım sitometri analizi gerçekleştirmek genişletilmiş hücreleri, hücre içi sitokin boyama / IFNγ ELISPOT, ve Cr 51 serbest deneyleri fenotip ve fonksiyonel kapasitesini değerlendirmek için. Tipik olarak oluşturulan hücreler CD4 + ve hem de T hücre bölümlerinde algılanabilir antijen-özgüllük ile CD8 + T hücreleri karışık bir nüfusa sahip poliklonal. CTL in vivo (Şekil 5) graft-versus-host hastalığı (GVHH) neden olmaması gerektiğini belirterek, virüs kısmen HLA uyumlu hedefler negatif viral antijen-ifade hedef hücreleri öldürmek ancak bunlarla. Şekil 1 rCTL ​​nesil protokol. Birincisi, DC'ler viral antijen-kodlama plazmid nucleofected ve ardından otolog PBMC bir R ile karışık: S 10 veya 20:01. Hücreler, sonra hasat edilmiş sayılır, işlev, kimlik ve sterilite için test ve daha sonra klinik kullanım için Kriyoprezerve IL4 ve IL7 varlığı için 10-14 gün, G-Rex genişletilmiştir. Şekil 2. Optimize edilmiş DNA plazmid, in vitro üstün T hücre aktivasyonuna neden olur . DC'ler optimize edilmiş, FDA uyumlu plazmid kodlama Hexon ve Penton (İlan), IE1 ve pp65 (CMV) ve EBNA1, LMP2 ve BZLF1 (EBV) veya aynı antijenleri kodlayan geleneksel pShuttle plazmid nucleofected. Bu T hücreleri uyarmak için kullanılır ve özgüllük IFNγ ELISPOT 10 gün stimülasyon ile analiz edildi. Şekil 3 Optimal DC: CTL aktivasyonu için T hücre oranları. Üç optimize plazmid 2 vericilerden DC'ler nucleofected ve sonra, 01:20 ya da 01:50 DC otolog PBMC teşvik etmek için kullanılır: PBMC oranı. IFNγ ELISPOT tarafından 10 günde yeniden T hücrelerinin sıklığı değerlendirildi. Şekil 4 artırılması sitokinler kullanarak G-Rex T hücre genişletme. Panel A, G-Rex cihaz yanı sıra mikroskopi tarafından değerlendirilir gaz geçirgen zar, CTL görünüm gösterir. Plakalar vs G-Rex tedavi kongre doku kültürü elde hücre çıkış arasında bir karşılaştırma da gösterilmiştir. B Paneli CMV pentamer olumlu CTL sitokin, tek başına IL4, IL7 yalnız ve IL4 + IL7 varlığı genişledi kültürleri elde sıklığını gösterir. Şekil 5. Genişletilmiş CTL fenotipi ve fonksiyonu. Ve CD8 + – Panel A CD4 + (yardımcı 45%) karışımı ile poliklonal genişletilmiş multivirus CTL, fenotipi bir temsili örnek gösterir (% 42 – sitotoksik) çoğunluğu (% 95) ifade olan T hücreleri, bellek işaretleyici CD45RO + / CD62L +. Paneli Yatak bu hücrelerin tüm uyarıcı antijenleri için spesifik olan ve IFNΓ, üretim ve antijen uyarımı sonrası TNF tespit hücre içi sitokin boyama tarafından değerlendirilir olarak polifonksiyonel vardır ki gösterir. Panel C genişletilmiş CTL ölçülen işlevsel olduğunu gösteren Cr 51 yöntemi ile. Otolog LCL, tek başına ya da CMV pp65 ifade eden bir boş vektör ya da bir adenoviral vektör ile transduced tar olarak kullanıldıolur. Alloreactivity allojenik PHA patlamalar kullanarak bir hedef olarak değerlendirildi.