1. El acondicionamiento de los peces receptores no transgénicos. Seleccione el pez más grande hombre en el sistema para el trasplante. Coloque el pescado en un 0,02% tricaína (pH 7) durante aproximadamente 3 minutos o hasta que deja de nadar, pero no tan largo que el corazón deja de latir. Ponga el pescado anestesiado sobre una toalla de papel húmeda en una mesa de trabajo. Use una aguja de la jeringa de insulina para inyectar 40 ug de gentamicina en 20 l de agua en la cavidad intraperitoneal de los peces. Para los estudios de regeneración renal, este paso es importante para la inducción de un ambiente favorable para el injerto mejorado. Poner el pez en el agua del sistema para la recuperación. El pescado puede ser dócil y muy sensible a los estímulos externos como la vibración. Después de 3 horas de recuperación, el tratamiento de los peces con 25 grises de rayos gamma. Ponga el pescado de nuevo en el sistema durante 3 días sin comer antes del trasplante. 2. Preparación de las células progenitoras de donantes genéticamente etiquetados con un marcador fluorescente (EGFP o mCherry). Justo antes del procedimiento quirúrgico, preparar las células del donante para ser trasplantadas y mantener en hielo. Para los estudios renales, se utiliza toda células de la médula del riñón de la Tg (cdh17: EGFP) línea transgénica, que contiene células progenitoras hematopoyéticas y renal. Estas células progenitoras son genéticamente etiquetados y sólo se expresan EGFP si se injertan y se diferencian en células epiteliales renales. Otros tipos de células progenitoras de la etiqueta también se puede utilizar, como Tg (SCL: EGFP) de células madre hematopoyéticas o Tg (fli1a: EGFP) para progenitores angioblast trasplantes. Eutanasia tres peces adultos transgénicos, colocándolos en un 0,2% tricaína durante 5 minutos. Use una hoja de afeitar esterilizada para quitar de la cabeza y la cola, y tijeras de disección para realizar una incisión a lo largo de la parte ventral. Bajo un estereoscopio, eliminar todos los órganos internos en la cavidad del cuerpo como la vejiga natatoria con pinzas. Tenga cuidado de no extraer el riñón, que es un órgano plano y pigmentadas pegado a la pared dorsal de la cavidad. A continuación, diseccionar el riñón de la pared dorsal y colocarlo en un tubo centrífugo de 1,5 ml que contiene 300 l de solución salina fría tampón fosfato suplementado con 2% de suero fetal bovino (PBS 1X / 2% de FCS). Use un mazo para cortar el riñón hasta que se homogeniza. Colocación de un filtro 40 uM de células dentro de un tubo Falcon de 50 ml y la transferencia de la solución de células en la parte superior del filtro de la célula, permitiendo que las células sueltas de filtrar a través de en el tubo Falcon. Use la mano del mortero con suavidad frotis las grandes piezas de tejido que se quedan en el colador para romper aún más a las células. Deje la solución de células en el tubo Falcon y lavar el filtro con 1,2 ml de 1X PBS / FCS al 2% para recoger las células residuales de la coladera. La transferencia de la solución de células en un tubo de 1,5 mL nuevo y se centrifuga a 4 ° C a 300 rcf durante 5 minutos. Lavar el pellet de células con 1,5 ml de PBS 1X / 2% de FCS y pasarlo por un colador para filtrar nuevos grupos de células pegajosas y centrifugar de nuevo. Resuspender el botón celular en 200 l de PBS 1X / 2% de FCS y la transferencia a un tubo de PCR. Centrifugar el tubo de PCR (4 ° C, 300 fcr, 1 min) y eliminar la mayor parte del sobrenadante. Resuspender las células en el sobrenadante residual para obtener un volumen final de 2.5 uL y lo almacena en hielo. Rendimiento celular final debe ser de aproximadamente 2 millones de células por los riñones. Cuente el número de células con un hemocitómetro y ajustar la concentración de 5 x 10 5 células por ul. 3. Cargue la solución de células en una jeringa Hamilton. Enjuague la jeringa Hamilton con agua estéril tres veces. Enjuague la jeringa con etanol al 75% 3 veces. Enjuague la jeringa de nuevo con 1X PBS / FCS al 2% 3 veces. A continuación, cargue la jeringa con 1 l de solución de células contienen aproximadamente 5 x 10 5 células de la misma antes de la inyección. 4. El trasplante de células progenitoras directamente en el riñón. Anestesiar a los peces receptores acondicionado en un 0,02% tricaína durante unos 3 minutos, o hasta que el pescado ha dejado de moverse, pero no demasiado largo que el corazón deja de latir. Bajo un microscopio estereoscópico, ponga el pez en una toalla de papel con la cabeza hacia el lado izquierdo, ventral hacia arriba, con el fin de secar la cara trasplantada. Extender encima el pescado para dejar al descubierto la parte seca. Con unas pinzas esterilizadas, extraiga las escalas en la región inmediatamente posterior a las branquias. Haga una incisión de 1 cm lateral en esta área en la línea media con un bisturí mientras se estabiliza el tejido con pinzas. Usando las pinzas, exponer el tejido sin dejar de hacer la incisión lo suficientemente profundapara exponer el riñón con la cabeza. Si hay una gran cantidad de sangrado que impide la visualización de los riñones, euthenize los peces y empezar de nuevo con otro pez receptor. Mientras curiosos del tejido para exponer el riñón cabeza, inyectar 1 l de la solución de células directamente en el riñón con la cabeza. Luego, en el mismo tiempo que la aguja de la jeringa se está recuperando, la liberación de las pinzas para que el tejido vuelve a caer en su lugar para evitar fugas de las células inyectadas. Mantenga una aguja de sutura con un controlador de la aguja y la traspasará a través del músculo en cada lado de la incisión. Tie-2 nudos y cortar el exceso de sutura. Sólo una única sutura que se necesita para una incisión de 1 cm. Coloque el pescado en los peces de agua que contiene 10 partes por millón de tricaína durante 5 horas para proporcionar a los peces con un efecto analgésico que calma. Coloque el pescado de nuevo en el sistema de recuperación con una alimentación normal. Después de 7-18 días de recuperación, diseccionar y analizar los peces injerto renal de células progenitoras de la fluorescencia en vivo EGFP. 5. Los resultados representativos: La estrategia global del trasplante se ilustra en la Figura 1. Para nuestros estudios renal, el riñón es diseccionado y analizado por EGFP fluorescencia. Injerto y la diferenciación de las células progenitoras renal se detecta tan pronto como siete días después del trasplante. Esto es evidente por la presencia de varios grupos de EGFP + células epiteliales renales (Figura 2). A los 18 días después del trasplante, se detecta un promedio de 24 EGFP + nefronas, lo que indica que las células del donante se han formado de tejido nuevo riñón (Figura 3). Para demostrar a largo plazo del injerto, se diseca un pez receptor de un trasplante después de 59 días (Figura 4). Este pez tenía muchas nefronas en el sitio de inyección (punta de flecha de color rojo), además de varias nefronas en sitios distantes (puntas de flecha blanca), lo que sugiere que las células progenitoras renal son migratorias. Esta técnica es más rápida y más eficiente en comparación a cuando las células se inyectan en la circulación a través del corazón, que dura aproximadamente tres meses para detectar el injerto. Figura 1. Esquema general del trasplante. Peces destinatario no transgénicos son irradiados para evitar el rechazo inmunológico de las células trasplantadas. Tres días más tarde, se hace una incisión en el flanco de los peces y las células progenitoras de los donantes se inyectan en el riñón la cabeza al descubierto. La incisión se cierra con una sutura y el pescado se coloca de nuevo en el sistema para la recuperación. Los riñones de los peces receptores se diseccionan en momentos posteriores y se analizaron para el injerto y la actividad de las células progenitoras. Figura 2. El injerto de células madre después de siete días. El injerto de células progenitoras renal se detecta en el lado de inyección del riñón cabeza a los siete días después del trasplante, según lo determinado por la presencia de grupos de EGFP + células renales epiteliales (recuadro – vista ampliada). Figura 3. El injerto de células madre después de 18 días Después de 18 días después del trasplante, se detecta un promedio de 24 EGFP + derivadas del donante nefronas (insertar – imagen ampliada de cada uno de EGFP + nefronas).. Figura 4. Injerto y la migración de las células progenitoras después de 59 días. Continuamos para detectar el injerto de las células progenitoras de largo después del trasplante, incluso después de 59 días (cabeza de flecha roja). En este punto más adelante, derivadas del donante nefronas se detectan en sitios fuera de la zona de inyección (puntas de flecha blanca), de conformidad con la migración de células progenitoras.
