השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

1. מיזוג של דגים שאינם מהונדס הנמען. בחר את הדג הזכר הגדול ביותר במערכת להשתלה. מניחים את הדגים Tricaine 0.02% (pH 7) למשך כ 3 דקות או עד שהוא מפסיק לשחות, אבל לא כל כך הרבה זמן הלב מפסיק לפעום. מכניסים את הדגים בהרדמה על מגבת נייר לח על גבי ספסל. השתמש מחט מזרק אינסולין להזריק 40 UG של גנטמיצין ב UL 20 של מים לתוך חלל intraperitoneal של הדג. עבור מחקרים התחדשות כליות, שלב זה חשוב גרימת סביבה נוחה עבור engraftment משופרת. מכניסים את הדג חזרה למים מערכת להתאוששות. הדג יכול להיות צייתן מאוד רגיש לגירוי חיצוני כגון רעידות. אחרי 3 שעות של התאוששות, לטפל בדגים עם אפור 25 של קרינה גמא. מכניסים את הדג חזרה לתוך המערכת במשך 3 ימים ללא מזון לפני ההשתלה. 2. הכנת התאים התורם אבי שכותרתו גנטית עם סמן פלואורסצנטי (EGFP או mCherry). רק לפני ההליך הכירורגי, להכין את התאים התורם להיות מושתלים ולשמור אותם על הקרח. עבור מחקרים כליות, אנו משתמשים כל מח כליות תאים מן (cdh17: EGFP) Tg קו מהונדס, המכילים ובתאים כליות hematopoietic. תאים אלה אבי מסומנים גנטית רק להביע EGFP אם הם נקלטים ו להתמיין לתאי האפיתל כליות. סוגים אחרים של ובתאים שכותרתו יכול גם לשמש, כגון Tg (SCL: EGFP) עבור תא גזע hematopoietic או Tg (fli1a: EGFP) להשתלה אבות angioblast. להרדים 3 דגים בוגרים מהונדס ידי הצבת אותם Tricaine 0.2% במשך 5 דקות. השתמש סכין גילוח מעוקרים כדי להסיר את הראש והזנב, ומספריים לנתח לעשות חתך קו האמצע בצד הגחון. תחת stereoscope, להסיר את כל האיברים הפנימיים בחלל הגוף כולל שלפוחית ​​השתן לשחות עם פינצטה. היזהר שלא להסיר את הכליה, שהיא איבר שטוח פיגמנט מחובר לקיר הגבי של חלל. בשלב הבא, לנתח את כליה מן הקיר הגבי ומקום אותו לתוך צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגה המכילה 300 UL של תמיסת מלח פוספט חיץ קר בתוספת 2% עוברית עגל בסרום (1X PBS FCS / 2%). השתמש העלי לכליה גזירה עד שהוא הופך הומוגני. מניחים מסננת 40 תא UM בתוך צינור פלקון 50 מ"ל ולהעביר את הפתרון הנייד על גבי מסננת התא, המאפשר לתאי רופף לסנן דרך לתוך הצינור פלקון. השתמש העלי למרוח בעדינות את חתיכות גדולות של רקמה שנשארו על המסננת כדי להמשיך לשבור את התאים. השאר את פתרון התא בצינור פלקון ולשטוף את מסננת עם 1.2 מ"ל של 1X PBS FCS / 2% לאסוף שאריות תאים מן המסננת. מעבירים את הפתרון הנייד לתוך צינור 1.5 מ"ל ו צנטריפוגה חדשה ב 4 ° C ב RCF 300 במשך 5 דקות. שטפו את תא גלולה עם 1.5 מ"ל של 1X PBS FCS / 2% ולהעביר אותה דרך מסננת חדשה לסנן גושים של תאים דביקים צנטריפוגות שוב. Resuspend התא גלולה ב UL 200 של 1X של PBS FCS / 2% ו להעביר צינור PCR. צנטריפוגה הצינור PCR (4 ° C, 300 RCF, 1 דקות) ולהסיר את רוב supernatant. Resuspend התאים supernatant השייר לקבל נפח 2-5 הסופי UL ולאחסן אותו על הקרח. תשואה הסלולר הסופי אמור להיות כ -2 מיליון תאים לכל כליה. ספירת תאים עם hemocytometer ולהתאים את הריכוז 5 x 10 5 תאים לכל UL. 3. טען את הפתרון הנייד לתוך מזרק המילטון. יש לשטוף את המזרק המילטון עם מים סטריליים 3 פעמים. יש לשטוף את המזרק עם 75% אתנול 3 פעמים. יש לשטוף את המזרק שוב עם 1X PBS / 2% FCS 3 פעמים. ואז לטעון את המזרק עם 1 UL של פתרון התא מכילים כ 5 x 10 5 תאים ממש לפני הזריקה. 4. השתלה של ובתאים ישירות לתוך הכליה. להרדים את הדג הנמען מותנה Tricaine 0.02% למשך כ 3 דקות, או עד שהדג הפסיק לזוז, אבל לא יותר מדי זמן כי הלב מפסיק לפעום. תחת stereomicroscope, להניח את הדג על מגבת נייר עם הראש לכיוון צד שמאל, עד הגחון, כדי לייבש את הצד המושתל. ואז לגלגל את הדג על מנת לחשוף את הצד יבשים. בעזרת פינצטה מעוקרים, להסיר את הכף באזור האחורי מיד הזימים. בצע חתך 1 ס"מ לרוחב בתחום זה על קו האמצע עם אזמל בעוד בייצוב רקמות עם פינצטה. בעזרת פינצטה, לחשוף את הרקמה תוך כדי להפוך את חתך עמוק מספיקכדי לחשוף את הכליה הראש. אם יש הרבה דימום שמונעת להדמיה של הכליה, euthenize הדגים ולהתחיל מחדש עם דג אחר הנמען. בעוד חטטניות רקמה פתוחה לחשוף את הכליה ראש, להזריק 1 UL של הפתרון הנייד ישירות לתוך הכליה הראש. ואז, באותו זמן כמו מחט המזרק מתבצעת להאסף, לשחרר את פינצטה כך רקמות נופל בחזרה למקומו, כדי למנוע דליפה של התאים מוזרקים. החזק מחט תפר עם נהג המחט לדקור אותו באמצעות שריר בכל צד של החתך. עניבה 2 קשרים לנתק את תפר עודף. רק תפר אחד דרוש חתך 1 ס"מ. מניחים את הדגים במים דגים המכיל 10 חלקים למיליון של Tricaine במשך 5 שעות כדי לספק דגים עם אפקט משכך כאבים מרגיע. מניחים את הדגים חזרה לתוך המערכת להתאוששות עם האכלות נורמלי. לאחר 7-18 ימים של התאוששות, אנו מחלקים את הדג ולנתח engraftment של ובתאים כליות על ידי חיים EGFP פלואורסצנטי. 5. נציג תוצאות: האסטרטגיה הכוללת של ההשתלה מתוארת באיור 1. עבור מחקרים הכליות שלנו, הכליה הוא גזור ונותחו על ידי EGFP פלואורסצנטי. Engraftment והבחנה של ובתאים כליות מתגלה מוקדם ככל השתלת ימים seven הודעה. הדבר בא לידי ביטוי על ידי נוכחות של מספר רב של אשכולות EGFP + בתאי אפיתל הכליה (איור 2). עד 18 ימים שלאחר ההשתלה, נזהה ממוצע של 24 + EGFP nephrons, המציין כי תאים התורם יצרו רקמת הכליה החדשה (איור 3). כדי להדגים לטווח ארוך engraftment, ניתחנו דג מקבל 59 ימים שלאחר ההשתלה (איור 4). דגים זה היה nephrons רבים באתר ההזרקה (חץ אדום) בנוסף nephrons מרובות באתרים מרוחקים (ראשי חץ לבן), טוען כי ובתאים כליות הן נודדות. טכניקה זו היא מהיר ויעיל יותר בהשוואה כאשר התאים מוזרקים למחזור הדם דרך הלב, אשר לוקח כשלושה חודשים לזהות engraftment. באיור 1. התכנית כוללת של דגים השתלת Non-מהונדס. הנמען הם מוקרן לדכא דחייה חיסונית של התאים המושתלים. שלושה ימים לאחר מכן, הוא עשה חתך באגף של הדג ובתאים התורם מוזרקים כליה ראש חשוף. החתך נסגר עם תפר אחד הדגים ממוקמות חזרה לתוך המערכת לצורך התאוששות. הכליות של דגים והנמען גזור בנקודות זמן לאחר מכן ניתח עבור engraftment פעילות אבי. איור 2. Engraftment של ובתאים לאחר שבעה ימים. Engraftment של ובתאים כליות מזוהה בצד מוזרק של הכליה ראש על השתלת ימים seven לפרסם, כפי שנקבע על ידי נוכחות של צברים של תאים EGFP + כליות אפיתל (הבלעה – תצוגה מוגדלת). איור 3. Engraftment של ובתאים לאחר 18 ימים לאחר ההשתלה 18 ימים הודעה, נזהה בממוצע EGFP 24 + תורם הנגזרות nephrons (הכנס – תצוגה מוגדלת של הפרט EGFP + nephrons).. איור 4. Engraftment והגירה של ובתאים לאחר 59 ימים. המשכנו לזהות engraftment של ובתאים ארוכה לאחר ההשתלה, גם לאחר 59 ימים (ראש חץ אדום). בנקודה זו בזמן מאוחר יותר, התורם הנגזרות nephrons מזוהים באתרים הרחק ההזרקה (לבן ראשי חץ), עולה בקנה אחד עם נדידת תאים ובתאים.