直接进入成年斑马鱼的肾细胞移植

1。空调的非转基因收件人鱼类。 选择在系统中用于移植的最大公鱼。 将在0.02％Tricaine的鱼（pH值7），约3分钟，或直至它停止游泳，但没有这么长，心脏停止跳动。 麻醉鱼湿纸巾放在一条长凳上方。 使用胰岛素注射器针头2​​0 UL水成鱼的腹腔腔注入庆大霉素的40微克。对于肾功能再生的研究，这一步很重要，诱使一个有利的环境，增强植入。 鱼放入水系统的恢复。 鱼可被驯服的和非常敏感的震动等外部刺激。经过3个小时的恢复，治疗25伽玛射线的灰色的鱼。 将没有食物移植前3天的鱼放回系统。 2。祖供体细胞的制备，用荧光标记（EGFP或者mCherry）基因标记。 手术过程前，准备捐助移植的细胞，并保持他们在冰上。 对于肾功能的研究中，我们使用全肾从TG（cdh17 EGFP）的骨髓细胞转基因株系，其中包含肾脏和造血祖细胞。这些祖细胞的基因标记，并仅表达EGFP的，如果他们嫁接和肾小管上皮细胞分化成。也可用于其他类型的标记的祖细胞，如造血干细胞或TG（fli1a：EGFP）angioblast祖细胞移植的TG（SCL：EGFP ）。 放置5分钟，他们在0.2％Tricaine安乐死3成年转基因鱼。 使用消毒刀片去除头部和尾部，和解剖剪刀，沿腹方一个正中切口。 在一个立体，删除所有在腔体内，包括镊子鱼鳔的五脏六腑。不小心取出肾脏，这是一个单位和色素的器官，腔背墙。 接下来，从背墙解剖肾脏，放入1.5 mL离心管含300冷磷酸盐缓冲生理盐水辅以2％胎牛血清（1X PBS / 2％FCS）UL。 使用杵剪切肾脏，直到它变得同质化。 将一个50毫升猎鹰管内40 UM细胞过滤器和转移的细胞过滤器上的电池解决方案，让松散的细胞进行筛选，通过猎鹰管。 使用杵轻轻涂抹，留在过滤器上，进一步打破了细胞组织的大块。 留在“猎鹰”管细胞溶液，并用1.2毫升的1X PBS / 2％FCS的过滤器，以收集过滤器的残余细胞。 转让4 ° C时，300 RCF 5分钟到一个新的1.5 mL试管和离心的电池解决方案。 用1.5 mL的1X PBS / 2％FCS中清洗细胞沉淀，并通过一个新的过滤器，过滤掉粘细胞的团块，离心再次。 200 UL的1X PBS / 2％FCS重悬细胞沉淀，并转移到PCR管。 离心机PCR管“（4℃，300 RCF，1分钟），除去上清液。 重悬细胞中的残留上清获得2​​-5 UL最终体积和存储在冰上。 最后蜂窝产量约200万个肾细胞。 计数与血球细胞的数量，并调整浓度至5 × 10 5细胞每微升。 3。汉密尔顿注射器装入电池解决方案。 汉密尔顿注射器无菌水冲洗3次。 注射器冲洗干净，用75％乙醇3倍。 注射器冲洗用1X PBS / 2％FCS的3倍。 1 UL细胞溶液中含有约5 × 10 5细胞注射前，然后装入注射器。 4。直接入肾移植的祖细胞。 在0.02％Tricaine的鱼约3分钟，或直至停止移动，但不会太长，心脏停止跳动的麻醉空调收件人鱼。 立体显微镜下，奠定了纸巾上，头向左侧，腹侧的鱼，以干燥移植方面。 然后滚鱼揭露干边。 使用消毒镊子，取出立即去鳃后在该地区的尺度。 用手术刀在这方面的一个1厘米中线外侧切口，同时稳定的组织用镊子。 使用镊子，公开的组织，同时继续深度不够，使切口揭露头肾。 如果有大量出血，防止肾脏的可视化，euthenize鱼，并开始与其他收件人鱼。 虽然撬组织公开揭露头肾，头肾直接注入1单元解决方案UL。 然后，在同一时间正在检索注射器针头，松开镊子，使组织分为放回原处，以防止泄漏注射的细胞。 握住缝合针一针驱动程序和皮尔斯通过切口两侧的肌肉。 铁2节，并切断多余的缝合。只有一个单一的缝合需要一个1厘米的切口。 包含5个小时的百万分之10的Tricaine提供一个平静的镇痛效果的鱼放置在鱼水之鱼。 将系统恢复正常喂食鱼背。 经过7-18天的恢复，我们解剖鱼和生活EGFP荧光分析肾祖细胞植入。 5。代表性的成果： 移植的总体战略是在图1所示。对于我们的肾脏研究，肾脏的解剖和EGFP荧光分析。被检测为早7天移植后的肾祖细胞植入和分化。由多个集群的EGFP +肾上皮细胞（图2）存在，这是显而易见的的。移植后18天，我们发现，平均24 EGFP +肾，这表明，供体细胞已经形成了新的肾组织（图3 ）。为了证明长期植入，我们解剖一个收件人鱼59天移植后（图4）。这种鱼有许多肾单位，在注射部位（红色箭头），除了在遥远的地方（白色箭头）的多个肾，表明肾祖细胞迁徙。这种技术是更快和更有效相比，当细胞注射进入血液循环通过心脏，它需要大约3个月检测植入。 图1。辐照抑制细胞移植的免疫排斥反应的移植。非转基因的收件人鱼的整体计划。三天后，切口是鱼和捐助者的祖细胞的侧翼暴露的头肾注入。关闭切口缝合和鱼放入回收系统。收件人鱼肾脏在稍后的时间点解剖和分析，植入和祖活动。 图2。祖细胞植入后七天 。肾祖细胞植入头肾在移植后7天注射方检测，集群的EGFP +肾小管上皮细胞的存在（插图-放大查看）确定。 图3。祖细胞植入后18天 ，移植后18天之后，我们发现24 EGFP的平均捐助者派生肾（插入-放大个人EGFP +肾） 。 图4。植入后59天祖细胞的迁移 。我们继续检测祖细胞移植后长期植入，即使经过59天的（红色箭头头） 。在稍后的时间点，捐助派生肾站点检测到远离注射液（白色箭头头）的网站，与祖细胞的迁移一致。