Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

1. Hücre kültürü Kortikal nöronların izole ve önceden açıklanan teknikler ve poli-D-lizin ve laminin 1 ile kaplanmış bir cam alt (Mattek Corporation, Ashland, MA) ile kültür kaplarına kaplama kullanılarak yetiştirilir. 2. Floresan probları TMRM ve H 2 DCF-DA için stok çözümler hazırlanması TMRM, 5.0 mg 1 ml susuz dimethylsülfoksit eriterek TMRM 10 mM stok solüsyonu hazırlayın. Vortex 1 dak. Sonra, alikotları yapmak ve -20 ° C'de saklayın, ışıktan korumak, ve bir ay içinde kullanın. Sonra, susuz DMSO 1 ml H 2 DCF-DA 4.87 mg eriterek H 2 DCF-DA 10 mM stok solüsyon hazırlanır. Benzer şekilde, vorteks 1 dak. Sonra, alikotları yapmak ve -20 ° C'de saklayın, ışıktan korumak, ve bir hafta içinde kullanabilirsiniz. 3. TMRM ve H 2 DCF-DA ile yükleme sıçan kortikal nöronların TMRM mitokondri son derece negatif yüklü iç birikir potansiyometrik, hücre-geçirgen floresan gösterge. Mitokondriyal TMRM otomatik söndürme önlemek için TMRM düşük konsantrasyonlarda (10-50 nM aralık) kullanmak önemlidir. Sonra TMRM, floresan sinyal iç mitokondrial membran genelinde ΔΨm doğrudan işbirliği ile ilgili olabilir. ΔΨm kaybı floresan yoğunluğu kaybı ile sonuçlanan mitokondri sızması TMRM neden olur. H 2 DCF-DA hücre geçirgen prob, hücre içi esterazlar tarafından DCF-DA dönüştürülür ve floresan DCF oksidasyon sonuçları . Yüksek yükleme konsantrasyonları DCF floresan doygunluk H 2 O 2 yokluğunda bile neden olabilir DCF-DA, 2-10 mcM ve arasında değişmektedir H 2 farklı beyin bölgelerinden elde edilen nöronların nihai konsantrasyonu ampirik olarak test edilmelidir . Herhangi bir endojen veya eksojen oksidan varlığı (örneğin, nitrik oksit, hidrojen peroksit) DFC floresan yoğunluğu artacaktır. Aşağıda, TMRM ve H 2 DCF-DA ile sıçan kortikal nöronların yükleme için bir protokol sağlar. TB:: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukoz, 1.5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, ve 10 TMRM ile sıçan kortikal nöronların yüklemek için, ilk, Tyrode Kullanıcı tampon (Paylaşımlı Metin kültürlü nöronlar 3 kere yıkayın mM HEPES;) NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın. Ardından, TB 1 / 1000 kere 10 mM TMRM stok seyreltilmesiyle TMRM 20 nM hazırlamak ve daha sonra 2 TB başına 1 ml seyreltilmiş TMRM ul ekleyin. 45 dakika oda sıcaklığında karanlıkta TMRM nöronlar inkübe edin. 45 dakika sonra, mikroskop sahnede kültür çanak montaj ve görüntüleme başlayın. H 2 DCF-DA ile sıçan kortikal nöronların yüklemek için, TB kültür nöronlar 3 kez yıkayın. Sonra, TB 10 mM H 2 DCF-DA stok 1 / 10 kez seyreltilmesi ile H 2 DCF-DA 2 mcM hazırlamak ve daha sonra 2 TB başına seyreltilmiş 1 ml H 2 DCF-DA ul ekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında 45 dakika karanlıkta H 2 DCF-DA nöronlar kuluçkaya yatmaktadır. 45 dakika sonra, görüntüleri almadan önce aşırı floresan gösterge kaldırmak için TB nöronlar 4 kere yıkar. 4. ΔΨm belirlemek için TMRM ile inkübe nöron görüntüleme Canlı TMRM, konfokal lazer tarama mikroskobu (Metin Yerleşimi: EKK 510, Carl Zeiss A.Ş.) ile inkübe nöronların canlı görüntüleme gerçekleştirmek için, canlı zaman serisi programı uygulaması ile kullanılır. Görüntüleri elde etmek ve photobleaching önlemek için gerekli zamanı en aza indirmek için; düşük çözünürlüklü ve zayıflatılmış lazer gücü (düşük çözünürlüklü lazer gücü:% 1: 256 x 256 Metin Dağılımı) uygulayın. . Sonra, yansıyan ışık kullanılarak TMRM yüklü monte nöronların odağı ayarlayın. TMRM floresan aydınlatma ve 514 nm 570 nm dalga boyunda tespit inceleyin. Doygunluk seviyesinin altında sadece bir kamera tespit kazanç ayarlayın. Görüntüleri elde etmek için çözünürlük, lazer gücü, bir kamera tespit kazanç ve zaman atlamalı aralığını içeren tüm parametreleri sonra; deneyler arasındaki bu ayarları değişmez. Ardından, alan değiştirmek. Görüntü toplamaya başlayın. FCCP veya 2 mcg / oligomycin ml, 1 mcM gibi uyaranlara ΔΨm değişiklikleri sınamak için, önemli ölçüde sırasıyla, mitokondriyal membran potansiyeli depolarize veya hyperpolarize hangi uygulanan olabilir. Bu değişiklikler TMRM floresan FCCP durumunda bazal floresan veya oligomycin durumunda TMRM floresan yoğunluğunda bir artış ile karşılaştırıldığında bir düşüş yansıyacaktır. 5. ROS belirlemek için H 2 DCF-DA ile inkübe nöronlar Canlı görüntüleme Inkübe nöronlar H 2 DCF-DA, ilk canlı görüntüleme gerçekleştirmek için, bir mikroskop aşamasında kültür çanak monte edin. Hücrelerinin odağı ayarlayıning yansıyan ışık. 488 nm eksitasyon ve 515 nm dalga boyunda emisyon DCF floresan inceleyin. Sonra% 5-7, dedektör kazanç ve 256 x 256 çözünürlükte, lazer gücü ayarlayın. Deneyler arasındaki bu ayarları değiştirebilirsiniz etmeyin. Sonra, zaman serisi programını kullanarak canlı görüntüler elde etmek için frekansını ayarlayın. Yeni bir alan seçin ve görüntüleri almak başlayabilirsiniz. ROS düzeylerinde değişiklikler tespit için, 100-200 mcM H 2 O 2 hücre tedavisi. Bu başlangıç ​​seviyesi ile karşılaştırıldığında DCF floresan yoğunluğunda bir artış ile yansıtılacaktır. 6. Veri analizi LSM program aracı: ilgi bölgesi (ROI Metin Dağılımı) alanlarını seçmek için kullanın. Sonra, TMRM veya ROS floresan yoğunlukları ölçmek. Mitokondriyal bölgelerde veya TMRM veya ROS floresan yoğunlukları sırasıyla ölçmek için görüntülü hücrelerinde tüm hücre gövdesi ROI'ler ROI'ler seçin. TMRM veya her zaman noktası için ROS için tüm görüntülü hücreleri için bütün hücre gövdeleri her hücrenin bütün ROI'ler ortalama floresan yoğunlukları hesaplayın. Eşiğe yoğunluğunu hesaplamak için hücrelerin yanında bölgeleri seçin. Çeşitli ölçümler ve ortalama arka planda yoğunluğunu hesaplamak. Microsoft Excel kullanarak her zaman noktası için her hücrede ROI'ler ortalama floresan yoğunlukları, ortalama bir arka plan floresan çıkarın. Arka plan yoğunluğu çıkarılarak sonra, bu formülü (: mesafe kadar taşınmış = FF o / F o x 100, F = bazal floresan için herhangi bir zaman noktasında = floresan yoğunluğu, Paylaşımlı Metin) kullanarak temel floresan TMRM veya DCF floresan yoğunluğu normale Sonra, zaman içinde floresan yoğunluğunda değişiklik gösteren arsa üretmek için Sigma Arsa programı kullanın. 7. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1A TMRM ile inkübe fare kortikal nöronların bir floresan görüntüyü gösterir. FCCP eklenmesi, mitokondriyal uncoupler, mitokondriyal depolarizasyon ve TMRM floresan yoğunluğu (Şekil 1B) kaybına yol açar. Bazal TMRM floresan seviyesi FCCP ek önce (Şekil 1C ilk 350 sn) sabit kalır. Kantitatif analiz, zaman içinde TMRM floresan değişiklikler TMRM floresan FCCP (Şekil 1C) eklenmesinden sonra önemli bir azalma gösterir. Şekil 1D DCF yüklü fare kortikal nöronların floresan görüntüyü gösterir. H 2 O 2 sonuç eklenmesi (Şekil 1E) hücre gövdeleri DCF floresan yoğunluğu arttı. Bazal DCF floresan seviyesi H 2 O 2 uygulama öncesi (ilk 120 sn) değişmez. Time-lapse DCF floresans ölçümleri istikrarlı düzeyleri gösterisi, H 2 O 2 tedavisi (Şekil 1F) sonra artış. Şekil 1 mitokondriyal membran potansiyeli ve canlı sıçan kortikal nöronların ROS düzeylerinin değerlendirilmesi. (A) kortikal nöronların Temsilcisi floresan görüntü TMRM yüklendi. Temel TMRM floresan taradıktan sonra, nöronlar protonophore FCCP (1 mcM) ile tedavi edildi. Sağda, parlak sarı ve siyah temsil maksimum ve minimum yoğunluğu, sırasıyla TMRM floresan Pseudocolor yoğunluğu bar. Mitokondriyal bölgelerden TMRM floresan kaybı FCCP tedavi (panel B) üzerine ΔΨm çöküşünü gösterir. Farklı zaman noktalarında TMRM floresan yoğunluğu değişim kantitatif gösterimidir FCCP tedavi öncesi ve sonrasında H2DCF-DA yüklü sıçan kortikal nöronların Floresan görüntü paneli C. (D). Temel DCF floresan belirlendikten sonra, hücrelerin 200 mcM H 2 O 2 ile tedavi edildi ve DCF floresan değişimi değerlendirildi. DCF floresan bir artış H 2 O 2 tedavisi (E) üzerine ROS düzeylerinde artış yansıtır. DCF floresan değişimi nicel analizi, H 2 O 2 tedavi öncesi ve sonrası paneli F. Ölçek çubuğu = 10 mm gösterilir Video.7.1 – labmedia 2704_Joshi.avi FCCP Ayrıca 40X objektif kullanarak öncesi ve sonrası kortikal nöronlarda TMRM hücre görüntüleme yaşayın. Pseudocolor yoğunluğu maksimum (FCCP toplamadan önce parlak sarı) ve (kırmızı renk, FCCP eklenmesinden sonra) FCCP eklenmesinden sonra TMRM floresan yoğunluğu azalmış Videoyu izlemek için buraya tıklayın Video. 7.5 – labmedia 2704_Joshi.avi 40X objektif kullanılarak, H 2 O 2 ek öncesi ve sonrası kortikal nöronlarda DCF hücre görüntüleme yaşayın. DCF floresan bazal hücre gövdeleri, açık yeşil renkli ve H2O2 Ayrıca DC artırırF parlak yeşil renkli floresan videoyu görmek için buraya tıklayın