Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion
Summary
Odaklanan bir bakteriyel patojen tarafından işgalinin ana hücrelerinin çalışma için genel bir protokol,<em> Staphylococcus aureus</em> Ve insan endotel hücreleri.
Abstract
İşte biz insan endotel hücreleri istila bakteriyel patojen Staphylococcus aureus çalışmanın nasıl anlatacağız. Genel protokol, hemen hemen her kültürlenebilen bakterinin hücre işgali çalışma yapılabilir. Örneğin aktin düzenlenmesi veya caveolae rolü işgali belirli yönlerini ele olabilir hangi aşamaları, vurgulanır. Konak hücrelerine şişeler yetişen ve kullanıma hazır manox lamelleri içeren 24 kuyucuğu içine numaralı seribaşı. Lamelleri kullanarak, kuyulardan (S. aureus eklemek için) tarafı üzerine yatırılır serum proteinlerinin kuyulardan hücrelerinin sonraki kaldırma girişimi azaltılması sağlanır . Bakteriler gerekli yoğunluğu büyüdü ve herhangi bir salgılanan proteinler (örneğin toksinler) uzaklaştırmak için yıkanır. Endotel hücreleri konfluent katmanları ile lameller bakteri eklenmesi önce taze kültür ortamı içeren yeni 24-kuyucuğu aktarılır. Bakteri ve hücreler daha sonra 37 o zaman gerekli miktarı için% 5 CO 2 birlikte inkübe edilir ° C S için aureus bu genellikle 15-90 dakika arasında. Manox lamelleri her kuyudan çıkarılmış ve unattached bakterileri kaldırmak için PBS daldırma yıkanır. Toplam ilişkili bakteriler (yapışık ve içselleştirilmiş) sayısal edilecekse, lamelleri sonra PBS içinde X-100% 0.5 Triton içeren yeni bir kuyu yerleştirilir. Nazik pipetleme hücre parçalama tamamlamak ve bakteriler agara seri seyreltme ve kaplama tarafından numaralandırılan açar. Hücreleri istila bakteri sayısı gerekli ise, tüm dış bakterileri öldürecektir gentamisin ve inkübasyon ile desteklenen 500 ul doku kültür ortamı içeren kuyu 1 saat boyunca devam etti, lamelleri eklenir. Lameller sonra yıkanabilir, parçalanmış hücreler ve yukarıda açıklandığı gibi bakteriler agara kaplama ile numaralandırılan. Deney doğrudan görselleştirme gerektiriyorsa, lamelleri sabit ve lekeli, ışık, floresan veya konfokal mikroskobu veya elektron mikroskobu için hazırlanmış olabilir.
Protocol
Discussion
Tarif tahlil ana hücreleri bakteriler tarafından işgali incelemek için yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır gentamisin koruma testi dayanmaktadır. Gentamisin ve diğer hücre içi bakteri öldürmek için antibiyotik edememe Gözlemler bakteri 4-8 ev sahibi hücrelerin işgali erken çalışmalarında kullanılmıştır. 24, 48 hatta 96-kuyucuğu kullanılması büyük miktarda zaman ve nispeten düşük maliyetle kısa bir süre içinde nicel ve tekrarlanabilir veri üretimi sağlar. Hiç uzman ekipman gerektirir, çeşitli bakteri ve hücreleri ile çalışmak için uygun olabilir, ve işgali 9 hem bakteri ve konak hücre süreçlerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir çünkü tahlil de çekici. Gerçekten de, ilk deneylerde bu yana, gentamisin koruma testinin yaygın konak hücre işgali ölçmek için bir dizi farklı bakteri veya bakteri 10,11 bile kombinasyonları istihdam edilmiştir. Temel ilkeler, yöntem aynı, çok ince varyasyonların olsa bildirilmiştir. Bu yazıda bizim sürümü açıklanan ve değişiklikler diğer bakteri veya konak hücreler için gerekli olabilir göstermiştir. Konak hücre işgali, dikkate alınması gereken önemli noktalar vardır bu yaklaşım kullanarak ölçmek için bir deney tasarımı:
Gentamisine Bakteriyel hassasiyet. Bu apaçık ortada, ama çalışılan bakteri konsantrasyonu, sıcaklık ve süre boyunca kullanılmak üzere gentamisin duyarlı olmasını sağlamak için önemlidir. Duyarsızlık söz konusu olduğunda, diğer antibiyotiklere 5 kullanmak mümkün olabilir. Parçalayıcı enzimler (lysostaphin, mutanolysin, lizozim) 12 kullanmak için alternatif bir yaklaşım olabilir.
Kuluçka ve inokulum ilk kez bu testte yaparken kullanılacak en uygun inkübasyon sürelerinde ve bakteriyel inokulum kurmak için önemlidir. Bu nedenle, ilk deneylerde, zaman içinde yapışma ve invazyon (6 saat 5 dakika) hem de incelemek gerekir. Bu işgali enfeksiyon çokluğu tarafından nasıl etkilendiğini değerlendirmek için de önemlidir (İçişleri Bakanlığı; hücre başına bakteri sayısı). Genel olarak bu kültür hücrelerinin hasarı azaltacaktır mümkün olan en az sayıda bakteri kullanmak en iyisidir. Uzun kuluçka dönemleri veya büyük inocula 9,13 kullanılması halinde suşlar arasında önemli farklılıklar kaçırmış olabilir.
Hücresel hasar kullanmadan önce bakterileri yıkamak önemlidir. Ancak, hücresel hasar toksin üretimi ile sınırlı değildir. Bakteriyel işgali, apoptoz ve normal hücresel işlevlerin bozulması indüksiyon hücre hasarına neden olabilir. Bu içselleştirilmiş bakterileri öldürerek ve işgali 14 oluştu olduğu izlenimi veren, gentamisin hücre içine nüfuz etmesine yol açabilir.
İnkübasyon koşulları, sıcaklık ve kültür ortamı bileşimi işgali üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir . Örneğin, HeLa hücrelerinde Streptococcus pyogenes tarafından işgali, genellikle serum 15 çözünür fibronektin, varlığı bağlıdır . Diğer bir önemli husus, kültür ortamında deney seyri sırasında bakteriyel büyüme.
Kültür ve hücre içi bakteri ölçümü. TX-100 hücre içi bakterileri öldürmek olsa da, onların büyüme inhibe edebilir. Gibi, katı ortam üzerinde deterjan varlığında bakteriyel çoğaltma kontrol etmek için önemlidir. Etkilenen nerede, deterjan düşük konsantrasyonlarda kullanmak veya böyle bir saponin alternatif olarak kullanmak mümkün olabilir. Kristal viyole boyama ve mikroskopi tahlil üzerinden gentamisin koruma testinin bir yararı da, yoğun daha az emek olduğunu ve bu algılama ve içselleştirilmiş bakteriler alt popülasyonlarının farklılaşma sağlar. Örneğin, S. aureus (NCT) ya da normal bir koloni tipi veya bireysel bakteri hücrelerinin mikroskobu ile ayırt edilebilir olmayacaktır küçük koloni varyant (SCV) 16, üretebilir. 17 'yaşayabilir ama olmayan kültürlenebilen' devlet tespit edilecektir girmek hücre içi bakteri ve hücre topaklanma muhasebeleştirilir gentamisin koruma tahlil üzerinde kristal viyole boyama ve mikroskopi tahlil bir yararı olabilir.
Bakteri istilası konak hücre süreçlerinin rolü incelenmesi. Birçok çalışma, aktin düzenlenmesi ile müdahale cytochalasin D, konak hücre fonksiyonu inhibitörleri istihdam var. Bu tür çalışmalar da antikorlar içerebilir hedef hücre yüzey reseptörleri ve belirli genlerin 18 siRNA demonte . Bu tedaviler kültür hücreleri canlılığını veya ek etkiler veya bakteriler üzerinde toksik etkilere sahip olduğunu sağlamak için hayati önem taşımaktadır.
Gelecekteki yönelimler:
Bu testte genellikle çok iyi hücre kültürü plakaları yapılır ontent "> Çünkü bu potansiyel hücre fonksiyonu inhibitörlerinin kütüphanelerin incelenmesi, enfeksiyonlar ya da ilgili olabilir, yüksek verimli bir tarama çalışma için uyarlamak için teorik olarak mümkün. hücre içi bakteri hedef için tasarlanmış antibiyotikler. Alternatif olarak, böyle bir yaklaşımın mutant kütüphaneler ekrana yapışma, işgal ya da hücre içi sağkalım ilgili genleri tanımlamak için kullanılan olabilir, bazı durumlarda model sistem kesme kuvvetleri (akış) de istenebilir Örneğin endotel modelleme zaman daha yakından in vivo ortamda taklit etmek için akış hücreleri ve mikroakışkan hücre kültürü sistemleri tasarımı ve üretimi, güncel gelişmeler, kesme kuvvetleri dahil konak-patojen modelleri gentamisin koruma tahlil istihdam imkanı da sağlar .Özetle, burada açıklanan protokol uzun yıllardır kullanılan benzer yaklaşımlar üzerine kuruludur. Bu yaygın kültür hücreleri ve bakteri türlerinin birçok türleri için geçerli olup, hızlı ve nispeten daha az maliyetle büyük miktarda veri oluşturabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Wellcome Trust (WT 0.795.880) tarafından finanse edildi.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | ||
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | ||
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | ||
| HUVECs | Lonza | CC-2519 | ||
| Endothelial basal medium | Lonza | CC-3121 | ||
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza | CC-4092 | ||
| Human endothelial growth factor | Lonza | CC-4017C | ||
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4035C | ||
| GA-1000 | Lonza | CC-4092C | ||
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | ||
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | ||
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher | TKT-210-330P | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886 | ||
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | ||
| T75 flasks | Thermo Fisher | 430641 | ||
| Cytochalasin D | Sigma | C2618 | ||
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma | 332615 |
References
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. v. o. n. Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
