세균성 병원체에 의해 인간의 세포의 침략

다음 프로토콜은 S.에 의해 내피 세포의 침략의 연구를 설명합니다 구균하지만은 이론적으로 모든 culturable 세균에 의해 세포 침략을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. S. 특정 단계 구균과 내피 세포가 표시됩니다. 1. 박테리아의 준비 문화 S. 37 10 ML 뇌 – 심장 주입 (BHI) 국물에 4-16 H (필수 성장 단계에 따라 다름) ° C 200 rpm으로 잡고 공중에 대한 구균의 변종. 이러한 성장 조건 S.에 대한 구체적인 구균 및 기타 세균에 맞게해야 할 수 있습니다. 실온 (5,000 X g, 10 분), DMEM의 상응하는 볼륨에있는 세균성 펠렛의 문화 뜨는 및 resuspension 제거에서 원심 분리의 다른 라운드로, 박테리아에게 Dulbecco의 수정된 이글의 중간에 세 번 (Invitrogen DMEM)을 씻으십시오. 필요에 따라 다음 조정할 수 있습니다 박테리아의 발생 정지의 광학 밀도를 측정합니다. S. 들어 구균, 우리는 ~ 10 9 cfu ML -1에 해당하는 OD 600 = 1에서 중지를 준비합니다. 2. 내피 세포 배양 37과 L – 글루타민 (2 ㎜) ° C 5 % CO 2를, 문화 DMEM에있는 내피 세포 라인 EA.hy926 1 태아 소 혈청 (10 % FBS)과 보완. 또는 풀링 기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs) Lonza (스위스 바젤)에서 구입하여 37 2% FBS, 소 뇌 추출물 (헤파린 포함), 인간 내피 성장 인자와 하이드로코티손와 보충 내피 기초 매체 교양 수 있습니다 ° C 5 % CO 2 제조 업체의 지침 (Lonza)에 따라. 이러한 성장 조건이 세포에 대한 구체적인되며 다른 숙주 세포 유형에 대한 적응해야 할 수 있습니다. 눈으로 확인, confluency 완료 T75 flasks의 내피 세포를 성장. coverslips의 삽입을위한 24 잘 접시를 준비합니다. 좋은 포셉는 (화염 소독) 1 불투명 하나 반짝 이는 표면을 가지고 coverslips를 이동 필요합니다. 셀 첨부 파일을 허용하는 이상 직면하고있는 불투명 표면 24 잘 접시의 우물에서 플레이스 coverslips. 3 ML 트립신 – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.25 %)와 T75 플라스크에서 세포를 해방 및 관련 문화 매체의 10 ML에 추가할 수 있습니다. Thermanox 유리 coverslips를 포함하는 24 잘 접시에 resuspended 셀 500 μl를 추가합니다. 세포 중 하나 T75 합류 플라스크는 약 5 × 잘 발생 당 10 5 세포를 (500 μl 매체) 두 24 잘 접시에 충분한 세포를 제공했습니다. 위에서 설명한대로 48 H에 대한 번호판을 품어하고, 거꾸로 가벼운 현미경에 의해 confluency 100 % 세포를 확인하십시오. 딥 – 세척 PBS에서 coverslips을 각 잘에서 10 % FBS를 포함한 DMEM 490 μl를 포함하는 새로운 24 잘 접시에 추가할 수 있습니다. 셀 침공에서 특정 대사 과정의 역할을 확인하려면, 저해제는 H 전 분석 기간 동안 유지 박테리아와 농도의뿐만 아니라 교양 세포 하나에 추가할 수 있습니다. 예를 들어, 미국에서 굴지의 다시 정리하기의 역할을 결정하기 위해 내피 세포의 구균의 침공, 50 μm의 cytochalasin D가 추가될 수 있습니다, 또는 caveolae 5의 역할에 대한 MM은 메틸 – β – 사이클로 덱스트린 추가할 수 있습니다. 3. 상륙 작전 분석 잘 10% FBS를 포함한 DMEM 490 μl의 내피 세포의 합류 레이어로 씻은 coverslip을 포함하는 각 씻어 세균 10 μl를 (약 2 × 10 7 cfu ML -1 S. 구균의 결과)을 추가합니다. 37 15-90분에 대한 품어 ° C를 5% CO 2인치 세포 (자기편과 internalized)과 관련된 세균의 총 수를 측정하려면 coverslips에게 PBS로 세 번 찍어 – 씻어과 PBS 500 μl 0.5 % 트리톤 X – 100을 포함하는 새 우물을 추가할 수 있습니다. 세포가 완전히 모든 internalized 박테리아를 lyse하고 릴리스하기 위해, 직접 coverslip의 표면에있는 피펫의 팁을 지적, 여러 번 피펫. TSA 플레이트의 표면에 액체 현탁액 (또는 필요의 dilutions)을 도금하여 박테리아를 열거합니다. TX – 100는 많은 그람 음성 박테리아를 lyse 때문에, 사포닌 대신이 사용할 수 있습니다. internalized 박테리아의 수를 측정하려면 각 물론 포함 언바운드 박테리아의 문화 뜨는을 제거하고 200 μg ML -1 gentamicin과 보충 500 μl DMEM/10 % FBS로 바꿉니다. 우리는 일상적으로 그것이 저렴 여기에 오히려 lysostaphin보다 gentamicin을 사용하여 우리가 실험 프로토콜을 변경하지 않고 세균의 종류 (예 : Staphylococci 및 Lactococci)를 사용하여 실험을 전환할 수 있습니다. 37 접시를 품어 ° C 모든 세포 박테리아를 죽이는 60 분 5 % CO 2인치 , coverslips에게 PBS로 3 회 씻어TSA에 도금하여 lyse 및 열거는 위의 부착 분석에 대해 설명했다. 어떤 경우에는 그것은 시각적으로 빛을 현미경을 사용하여 박테리아의 수를 계산하는 것이 바람직있을 수 있습니다. 이 경우, 그리고 특정 S.하기 구균 세포 침공은 물리적 세포외 박테리아를 파괴하는 대신 gentamicin의 lysostaphin (10 μg ML -1)을 사용합니다. 37 20 분 대한 coverslips을 품어 ° CO 2 C는 lysostaphin 솔루션에서 다음 씻어 Cytopath (Cellpath)로 수정. 5 분을위한 크리스탈 바이올렛 (0.5 %, W / V)와 coverslips을 홍수. 물, 공기 건조에 수영 – 씻어 유리 슬라이드에 탑재합니다. 합류 내피 세포의 mm 2 당 박테리아의 수는 빛을 현미경을 사용하여 계량하실 수 있습니다. 4. 대표 결과 : S. 표면에 fibronectin 단백질 바인딩 표현 (FnBPA 및 FnBPB) 구균은 내피 세포를 침공하는 능력을 수여. 최근 작업은 FnBPA 3 fibronectin 바인딩 도메인을 재정의했다. 야생 유형 (WT) S. 구균 8325.4 높은 효율과 내피 세포를 침공, FnBPA 및 B (Δ fnb)를 모두 부족 부담이 크게 감소 internalisation의 수준 (그림 1A)을 보여주었다 반면. 플라스미드 인코딩 fnb과 돌연변이의 Complementation 마이너스 fibronectin 결합 도메인 (pFnR0)는 (그림 1A) 침략을 추진하지 않았다. 반대로, 플라스미드 인코딩 전체 fnb WT 수준 (그림 1A)에 침략을 회복 유전자 (pFnBA4)와 돌연변이의 complementation. 내피 세포의 침공에 FnBPA의 역할도 heterologous 표현 호스트 Lactococcus lactis를 사용하여 제품 시연 수 있습니다. L.의 플라스미드 인코딩 FnBPA 표현 lactis (pRM9 9) 크게도 FnBPA (CTL)을 (오픈 바, 그림 1B) 표현하지 박테리아에 비해 내피 세포 접착력을 강화하지 않았다. 반대로, 난 FnBPA – 표현 lactis가 아닌 표현을 변형 (폐쇄 바, 그림 1B)보다 상당히 높은 수준에서 내피 세포를 침공. 실험은 네 중복의 시간과 평균 ± 표준 편차가 제시을 수행했다. *이 WT 또는 CTL 값에서 (P는 = <0.05) 통계적으로 크게 다른 데이터를 나타냅니다. 그림 1. EA의 침략. S.에 의해 내피 세포 Hy926 구균 (A) 또는 L. lactis (B).