細菌性病原体によるヒト細胞の浸潤

次のプロトコルは、S.の内皮細胞の浸潤の研究を紹介します黄色ブドウ球菌は、しかし、理論的には任意の培養可能な細菌による細胞侵入を研究するために使用することができます。 S.への特定の段階黄色ブドウ球菌と内皮細胞が示されている。 1。細菌の調製文化S. 37 10ミリリットルブレインハートインフュージョン（BHI）ブロス中で4月16日H（必要な成長段階に応じて）℃〜200 rpmで振盪しながら空気中のため黄色ブドウ球菌株。これらの成長条件は、Sの固有のものです黄色ブドウ球菌と他の細菌のために適切に調整する必要があります。 DMEMに相当量の細菌のペレットの培養上清と再懸濁の除去、室温で遠心分離の代替ラウンドで（5,000 × g、10分）;ダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen DMEM）中の細菌を3回洗浄する。その後、必要に応じて調節することができる細菌の得られた懸濁液の光学密度を測定します。 S.用黄色ブドウ球菌は、我々は、〜10 9 CFU ml -1のに対応するOD 600 = 1、懸濁液を準備。 2。内皮細胞培養文化ウシ胎児血清（FBS; 10％）を添加したDMEMで内皮細胞株EA.hy926 1 37時とL -グルタミン（2mMの）°、5％CO 2でCを。また、プールされた初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECを）ロンザ（バーゼル、スイス）から購入し、37℃で2％FBS、ウシ脳抽出物（ヘパリンを含む）、ヒト内皮成長因子およびヒドロコルチゾンを添加した内皮基礎培地で培養することができます° C、5％CO 2、メーカーの指示（ロンザ）によると。これらの成長条件は、これらの細胞に特異的であり、他の宿主細胞の種類に適応する必要があります。 目で検証、コンフルエントに完了するためにT75フラスコで内皮細胞を成長させる。 カバースリップの挿入のための24ウェルプレートを準備します。ファイン鉗子は、（火炎滅菌）1つの不透明な一光沢のある表面を持ってカバースリップを、移動するために必要である。細胞接着を可能にするために上向きに直面している不透明な面を持つ24ウェルプレートのウェルに配置してカバースリップ。 3ミリリットルトリプシン- EDTA（0.25％）とT75フラスコから細胞を解放すると、関連する培地10mlに加える。 Thermanoxのガラス製カバースリップを含む24ウェルプレートに再懸濁した細胞を500μlを添加します。細胞の一つT75コンフルエントフラスコは約5で得られた2 24ウェルプレート、× 1ウェルあたり10 5細胞（500μlの培地中で）のために十分な細胞を提供した。 前述のように48時間プレートをインキュベートし、反転光顕微鏡によるコンフルエント100％のセルを確認してください。 ディップ洗浄PBSでカバースリップをし、各ウェルに10％FBSを含む490μlのDMEMを含む新しい24ウェルプレートに加える。 細胞の浸潤における特定の代謝過程の役割を調べるために、阻害剤は培養細胞にアッセイ中に維持細菌や濃度を添加する前に1時間を追加することができます。例えば、S.のアクチン再構成の役割を決定する内皮細胞の黄色ブドウ球菌の侵入、50μMのサイトカラシンDを追加することができる、またはカベオラの役割のために、5mMのメチル-β-シクロデキストリンを添加することができる。 3。浸潤アッセイよく、10％FBSを含む490μlのDMEMで内皮細胞のコンフルエントな層で洗浄したカバースリップを含む各洗浄細菌の10μlを（約2 × 10 7 CFU ml -1の 黄色ブドウ球菌での結果）を追加します。 37℃で15〜90分間インキュベート° Cを5％CO 2で。 細胞（付着性と内部化）に関連する細菌の総数を測定するために、カバースリップをPBSで3回浸漬洗浄し、PBSで500μlの0.5パーセントトリトンX – 100を含有する新鮮なウェルに加える。細胞が完全にすべての内部化された細菌を溶解し、解放を確保するために、直接カバーグラスの表面でピペットの先端を指して、数回ピペッティング。 TSAプレートの表面に液体懸濁液（またはこの必要なの希釈液）をめっきによって細菌を列挙する。 TX – 100は多くのグラム陰性菌を溶解するので、サポニンは、代わりに2を使用できます。 内部化された細菌数を測定するために、各ウェルを含むバインドされていない細菌から培養上清を除去し、200μgのml -1のゲンタマイシンを添加した500μlのDMEM/10％FBSに交換してください。我々は日常的にそれが安価であるので、ここではなく、リソスタフィンよりゲンタマイシンを使用し、私たちは実験的なプロトコルを変更することなく、細菌の種類によって（ブドウ球菌とLactococci）を用いた実験を切り替えることができます。 37プレートをインキュベート℃、5％のC 60分間CO 2のすべての細胞外細菌を殺すために。 、カバースリップをPBSで3回洗浄する溶解し、上記の接着アッセイのために説明されているようにTSA上にめっきによって列挙する。 いくつかのケースでは、視覚的に光学顕微鏡を用いて細菌の数をカウントすることが好ましいかもしれない。このインスタンス内の、および特定のS.へ黄色ブドウ球菌の細胞浸潤は、物理的に細胞外細菌を破壊する代わりに、ゲンタマイシンのリソスタフィン（10μgのml -1）を使用してください。 37℃20分のためのカバースリップをインキュベート· CO 2のCは、リソスタフィンのソリューションで、その後すすぎとCytopath（Cellpath）で固定。 5分間クリスタルバイオレット（0.5％、w / v）のとカバーグラスを覆います。 空気乾燥、水に浸漬洗​​い、ガラススライド上にマウントします。コンフルエント内皮細胞の1mm 2あたりの細菌の数は、光学顕微鏡を用いて定量することができます。 4。代表的な結果： S.の表面上のフィブロネクチン結合タンパク質の発現（FnBPAとFnBPB） 黄色ブドウ球菌は、内皮細胞に侵入する能力を付与する。最近の研究は、FnBPA 3のフィブロネクチン結合ドメインを再定義しています。野生型（WT）S.黄色ブドウ球菌 8325.4はFnBPAとB（ΔFNB）の両方を欠いている株が内部化の有意な減少レベル（図1A）を示した一方、高効率で血管内皮細胞に侵入する。をコードするプラスミドのFNBと変異体の相補マイナスフィブロネクチン結合ドメイン（pFnR0は）（図1A）の侵入を促進しなかった。これとは対照的に、コードするプラスミドと変異体の相補全体FNB遺伝子（pFnBA4）はWTのレベル（図1A）に侵略を復元。 内皮細胞の浸潤におけるFnBPAの役割は、異種発現宿主ラクトコッカスラクティスを使用して実証することができます。 L.のプラスミドにコードされたFnBPAの発現ラクティス （pRM9 9）有意にないFnBPA（CTL）を（オープンバー、図1B）を発現しない細菌と比較して内皮細胞への接着を増強しなかった。対照的に、FnBPA発現L.ラクティスは、非発現株（クローズドバー、図1B）に比べ有意に高いレベルでの内皮細胞に侵入した。 実験は、重複に4回行ったし、平均値±標準偏差が表示されます。 * WTまたはCTLの値から（P = <0.05）統計的に有意に異なるデータを表す。 図1 EAの侵略。 S.のHy926内皮細胞黄色ブドウ球菌 （A）またはL.ラクティス （B）。