由细菌病原体入侵人体细胞

以下协议将介绍由S.研究内皮细胞的侵袭金黄色葡萄球菌 ，但理论上可以用来研究任何可培养的细菌细胞的入侵。 到 S阶段的具体金黄色葡萄球菌和血管内皮细胞的表示。 1。细菌的制备文化S。 4-16 H（上生长阶段所需而定）在10毫升的脑心浸液（BHI）肉汤在37 ° C在空气中晃动在200转金黄色葡萄球菌菌株。这些生长条件具体为S.金黄色葡萄球菌和可能需要对其他细菌的适应。 洗净细菌三个贝科的修改鹰的培养基倍（DMEM培养液; Invitrogen公司）离心备用轮在房间温度（5000 x 克 ，10分钟），去除一个的DMEM相当于体积的文化上清和的细菌沉淀重新悬浮。然后可以根据需要调整的细菌产生的悬浮测量光密度。为S.金黄色葡萄球菌，我们准备在外径600 = 1〜10 9 CFU毫升-1，对应暂停。 2。内皮细胞培养文化内皮细胞株EA.hy926 1的DMEM补充胎牛血清（FBS，10％）在37和L -谷氨酰胺（2毫米）℃，5％的CO 2。另外，汇集小学的人脐静脉（内皮细胞）的内皮细胞可以购买从龙沙（瑞士巴塞尔，）和内皮基底介质与2％FBS，牛脑提取物（包括肝素），人血管内皮生长因子和氢化可的松，在37培养℃，5％CO 2，根据制造商的说明（龙沙） 。这些增长的条件是针对这些细胞和其他类型的宿主细胞，可能需要适应。 血管内皮细胞生长在T75烧瓶完成汇合，用肉眼验证。 准备插入的盖玻片的24孔板。精细镊子（火焰消毒）需要移动盖玻片，其中有一个不透明的，表面有光泽。在24孔板与不透明表面朝上，让细胞附着井发生盖玻片。 从3毫升胰蛋白酶- EDTA（0.25％）与T75烧瓶中解放出来的细胞，并添加到10毫升的有关培养基。 添加500μL悬浮细胞Thermanox盖玻片的24孔板。一个T75细胞融合烧瓶两个24孔板提供足够的细胞，造成约5 × 10 5个细胞（500μL介质） 。 孵育48小时板块如上所述，并验证100％细胞汇合倒光镜。 浸在PBS冲洗盖玻片，并添加新的24孔板中，含有490μLDMEM培养液，每孔含10％胎牛血清。 为了研究细胞浸润在特定的代谢过程中的作用，抑制剂可以被添加到培养的细胞1小时之前，除了细菌和浓度保持在检测。例如，要确定的肌动蛋白重排的 S中的作用黄色葡萄球菌的内皮细胞的侵袭，50微米的细胞松弛素D可以添加或作用的小窝，5毫米甲基-β-环糊精可以增加。 3。侵袭实验加入洗净的细菌10μL（约2 × 10 7 CFU 毫升 -1金黄色葡萄球菌）以及包含在490μLDMEM培养液与内皮细胞的融合层含10％胎牛血清的一个洗涤盖玻片。 孵育15-90分钟，在37℃，5％CO 2的彗星。 要测量的细胞（贴壁和内在）的细菌总数，浸洗盖玻片在PBS的3倍，并添加到PBS中含有500μL0.5％Triton X – 100的的新鲜井。为了确保细胞充分裂解，并释放所有的内在细菌，吸几次，直接在盖玻片表面的尖端指向移液器。 列举细菌悬浮液（或稀释，这在必要时）TSA的板表面镀上。由于TX – 100裂解许多革兰阴性菌，皂甙，可以用来代替 2 。 要衡量化的细菌数量，请从每口井含有未绑定的细菌培养上清和替换500μLDMEM/10％FBS的补充200微克毫升-1庆大霉素。我们经常使用庆大霉素而比溶葡球菌酶，因为它是便宜的，让我们实验使用不同类型的细菌（如葡萄球菌和Lactococci）之间进行切换，而无需改变实验的协议。 板在37 ° C在5％CO 2为60分钟，杀死所有外细菌。 洗盖玻片在PBS的3倍，裂解枚举镀上TSA的描述上面的粘附实验。 在某些情况下它可能是最好目视计数使用光学显微镜的细菌数量。在这种情况下，具体到 S 金黄色葡萄球菌细胞的侵袭，使用溶葡球菌酶（-1毫升10微克），而不是庆大霉素，物理破坏外细菌。 在37 ° C的CO 2的溶葡球菌酶的解决方案，然后用清水冲洗并修复Cytopath（Cellpath）为20分钟盖玻片。 洪水与结晶紫（0.5％，W / V）为5min盖玻片。 浸在水，空气干燥冲洗，并安装到玻片上。利用光镜，可以量化融合的内皮细胞每平方毫米2的细菌数量。 4。代表性的成果： 纤维连接蛋白结合蛋白的表达 S的表面上（FnBPA和FnBPB ） 金黄色葡萄球菌赋予侵入血管内皮细胞的能力。最近的工作重新FnBPA 3纤维连接蛋白结合结构域。野生型（WT）S金黄色葡萄球菌 8325.4侵入内皮细胞具有效率高，而应变，缺乏FnBPA和B（ΔFNB）显示的内部化水平显着降低（图1A） 。与质粒编码FNB的突变体的互补A减去纤维连接蛋白结合结构域（pFnR0）没有促进入侵（图1A ）。相比之下，与质粒编码整个FNB（pFnBA4）入侵恢复到野生型水平（图1A）一个基因突变的互补性。 FnBPA在内皮细胞的侵袭中的作用也可以证明使用的异源表达主机乳酸乳球菌。表达质粒编码的FnBPA 在 L 球菌 （pRM9 9）没有显着增强附着力内皮细胞相比，细菌表达没有FnBPA（CTL）（开放的酒吧，图1B） 。相比之下，FnBPA表达L。比非表达株（封闭式酒吧，图1B）水平显着高于球菌入侵血管内皮细胞。 实验进行了四次重复和均值±标准差是。 *代表WT或CTL值显着性差异（P <0.05）的数据。 图1。EA的入侵。 Hy926内皮细胞由 S 金黄色葡萄球菌 （A）或L。球菌 （二）。