Induktion von Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen durch Alloantigen Stimulation mit Co-stimulatorische Signal Blockade

<p class="jove_title"> 1 ist. Vorbereitung der PBMC</p><ol><li> Verfahren für eine gute aseptische Technik und universellen Vorsichtsmaßnahmen müssen während der Durchführung dieses Protokolls eingehalten werden.</li><li> Isolate von gesunden freiwilligen Spendern PBMC durch Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Hypaque. Alternativ kryokonservierten PBMC können wiederbelebt werden.</li><li> Graf lebensfähig PBMC nach Färbung mit Trypanblau mit einer Zählkammer. Resuspendieren PBMC in völliger Kulturmedien (CM) in einer Konzentration von 1 Mio. lebensfähige Zellen / ml in einem 15 ml Falcon-Röhrchen.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Einrichten der Bulk Alloanergizing Co-Kultur</p><ol><li> PBMCs von zwei verschiedenen Spendern sind nötig, um die alloanergization Kulturen. Zellen von einem Spender dienen als Responder und Zellen von einem anderen Spender als Stimulator (der so genannten First Party Stimulator) dienen soll.</li><li> Platz 10 Mio. Stimulator PBMC bei 1 Mio / ml in einem 15 mL Falcon-Röhrchen und fügen 100mg Anti-B7.1 und 100mg Anti B7.2 Antikörper gegen Kostimulation zu blockieren. Vorsichtig geschwenkt, das Rohr und Inkubation für 30 Minuten. Inkubationsbedingungen für diese und alle weiteren Schritte sind 37 ° C / 5% CO₂ / 80% Luftfeuchtigkeit</li><li> Bestrahlen Stimulator PBMC (3,3 Gy) und fügen Sie einen T-25 50cm³ Zellkulturflasche mit einer gasdurchlässigen Kappe. Beschriften Sie die Flasche "Bulk alloanergizing Co-Kultur".</li><li> Add 10mL der Responder PBMC (bei 1 Mio / ml in CM) in den Kolben.</li><li> Fügen Sie eine weitere 100mg jeder anti-B7.1 und B7.2 anti-Antikörper und vorsichtig mischen vor dem Platzieren der Kolben aufrecht in einem Inkubator für 72 Stunden</li></ol><p class="jove_title"> 3. Einrichten des Bulk-Control-Co-Kultur</p><ol><li> Platz 10 Mio. Stimulator PBMC (bei 1 Mio / ml) in einem 15 ml Falcon-Röhrchen.</li><li> Bestrahlen 10 Millionen Stimulator PBMC (3,3 Gy). Und fügen eine 50cm³ Zellkulturflasche. Label "Bulk-Steuerung Co-Kultur".</li><li> Add 10mL der Responder PBMC bei 1 Mio / ml in CM in den Kolben und vorsichtig mischen vor dem Platzieren der Kolben aufrecht in einem Inkubator für 72 Stunden.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Einrichten des primären gemischten Lymphozyten-Reaktion (MLR), um die Wirksamkeit von Co-stimulatorische Blockade Measure</p><ol><li> Die Wirksamkeit von kostimulatorischen Blockade ist in eine primäre MLR, die bis über PBMC von der Masse alloanergizing und Kontrolle Co-Kulturen eingestellt ist gemessen</li><li> Der primäre MLR wird am selben Tag, dass der Großteil Kulturen eingerichtet wurden eingestellt</li><li> First-Label ein U Talsohle 96 Well-Platte "Primary MLR" für jeden der drei Zeitpunkten gemessen werden soll (Tag 4, 5 und 6 nach der Platten eingerichtet sind) werden.</li><li> Dekantieren 5 ml von jeder der Bulk-Steuerung und alloanergizing Co-Kulturen in 15 mL Falcon-Röhrchen.</li><li> Pipette 200 ml Zellsuspension aus jedes Falcon-Röhrchen in dreifacher Ausfertigung Brunnen auf jeder Platte. Label diese Brunnen "keine kostimulatorischen Blockade (CSB)" für die Zellen aus dem Bulk-Steuerung Co-Kulturen und "CSB" für die Zellen von der Masse alloanergizing Co-Kulturen</li><li> Add 200 ml CM bis 6 Bohrungen auf jeder Platte als negative Kontrollen. 200 ml PBS ist es, alle leeren Vertiefungen gegeben, um Verdunstung zu reduzieren. Legen Platten in den Inkubator.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Einrichten des sekundären MLR, die Wirksamkeit von Alloanergization Measure</p><ol><li> 72 Stunden nach dem Einrichten des Bulk-Co-Kulturen sind Rest-alloresponses in alloanergized PBMCs in eine sekundäre MLR gemessen. In der sekundären MLR, PBMC von beiden den Großteil alloanergizing Co-Kultur und der Großteil Kontrolle Co-Kultur werden gewaschen und mit bestrahlten allostimulator PBMC restimuliert</li><li> So richten Sie die sekundäre MLR-Label ein U Talsohle 96 Well-Platte "Secondary MLR" für jeden der drei Zeitpunkten gemessen werden soll (Tag 3, 5 und 7 nach Einrichtung) werden.</li><li> Entfernen 5mL aus jedem der Bulk-Steuerung und alloanergizing Co-Kulturen, Transfer zum 15mL Falcon-und Zentrifugenröhrchen für 5-10 Minuten bei 2000 rpm.Aspirate den Überstand vorsichtig, stören das Pellet, fügen Sie 10 mL der CM und Zentrifuge die Zellen wieder. Wiederholen Sie diesen Waschschritt.</li><li> Resuspendieren der Zellen in 1ml von CM. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypan-Blau-Färbung, und passen Sie die Zellkonzentration auf 1 Mio. lebensfähige Responder-Zellen / ml.</li><li> Pipette 100 ml Zellsuspension aus jedes Falcon-Röhrchen in dreifacher Ausfertigung Vertiefungen jeder Platte. Label diese Brunnen "First Party (FP) allorestimulation"</li><li> Pipette 100 ml Zellsuspension aus jedes Falcon-Röhrchen in eine weitere 3 Brunnen auf jeder Platte und Label diese Brunnen "CD3/28 Stimulation"</li><li> Um Stimulatorzellen für die sekundäre MLR vorzubereiten, zu isolieren PBMC aus frischem Blut (oder wieder zu beleben kryokonservierten PBMC) aus dem gleichen gesunden Spenders verwendet werden, um erste Partei Stimulator PBMCs in der alloanergizing und Kontrolle Kulturen zu versorgen.</li><li> Suspend PBMC aus dem FP-Donor in einer Konzentration von 1 Mio / ml und bestrahlen (3.3Gy)</li><li> Add 100 ml von bestrahlten Stimulator-Zellen in die Vertiefungen der Aufschrift "FP allorestimulation"</li><li> Für positive Steuerelemente, Add je 1 mL der CD3-und CD28 monoklonalen Antikörpern und 98mL des CM in die Vertiefungen der Aufschrift "CD3/28 Stimulation". Add 200 ml CM bis 6 Bohrungen auf jeder Platte als negative Kontrolle und 200ml PBS zu leeren Brunnen. Legen Sie die Platten in den Inkubator.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Die Messung der Spezifität der Alloanergization</p><ol><li> Die Spezifität der alloanergization wird durch den Vergleich Proliferation von Responder-Zellen aus dem abgeschlossenen alloanergizing und Kontrolle Co-Kulturen nach Stimulation mit bestrahlten PBMC von einer "dritten Partei" gesunden Spenders (dh eine andere Geber für die First Party) in eine sekundäre eingenommen bestimmt MLR.</li><li> Label drei 96-Well-Platten "Secondary MLR Spezifität" Day 3, 5 und 7.</li><li> Entfernen 5mL aus jedem der Bulk-Steuerung und alloanergizing Co-Kulturen Transfer zum 15mL Falcon-und Zentrifugenröhrchen für 5-10 Minuten bei 2000 Umdrehungen pro Minute. Saugen Sie den Überstand vorsichtig, stören das Pellet, fügen Sie 10 mL der CM und Zentrifuge die Zellen wieder. Wiederholen Sie diesen Waschschritt.</li><li> Resuspendieren der Zellen in 1ml von CM. Zählung mit Trypanblau-Färbung, und passen Sie die Zellkonzentration auf 1 Mio. lebensfähige Responder-Zellen / ml.</li><li> Zum Dritten Stimulatorzellen für die sekundäre MLR vorzubereiten, zu isolieren PBMC aus frischem Blut (oder wieder zu beleben kryokonservierten PBMC) aus einer neuen gesunden Spenders. Pipette 100 ml Zellsuspension aus jedes Falcon-Röhrchen in dreifacher Ausfertigung Vertiefungen jeder Platte. Label diese Brunnen "TP allostimulation"</li><li> Suspend PBMC von einem TP Spender auf 1 Million / ml und bestrahlen (3,3 Gy)</li><li> Add 200 ml bestrahlter TP Stimulatorzellen in die Vertiefungen der Aufschrift "TP allostimulation"</li><li> Die Spezifität der alloanergization kann auch durch einen Vergleich Proliferation von Responder-Zellen aus dem abgeschlossenen alloanergizing und Kontrolle Co-Kulturen nach Stimulation mit einer ansteckenden Erreger wie CMV festgestellt werden. Für diesen Schritt ist es wichtig, Responder PBMC von Spendern mit zuvor gezeigt, proliferative Reaktionen auf CMV-Lysat verwenden.</li><li> Label drei 96-Well-Platten "Secondary MLR CMV" Day 3, 5 und 7.</li><li> Zur Vorbereitung der Responder-Zellen für die sekundäre MLR zu CMV Reaktionen zu messen, Transfer 5 ml von jeder der Bulk-Steuerung und alloanergizing Co-Kulturen bis 15 ml-Tuben und waschen, zu zählen und bei 1 Mio. Zellen / ml resuspendieren in CM, wie zuvor beschrieben . Pipette 100 ml Zellsuspension aus jedes Falcon-Röhrchen in ein 3 Bohrungen auf jeder Platte.</li><li> Add 0,1 ml CMV-Lysat in 100 ul CM in die Vertiefungen</li><li> Add 200 ml CM bis 6 Bohrungen auf allen Platten als negative Kontrolle und fügen 200ml PBS zu leeren Brunnen. Legen Sie die Platten in den Inkubator.</li></ol><p class="jove_title"> 7. Mess-Proliferation in der primären und sekundären MLR</p><ol><li> Responder Zellproliferation wird durch Thymidin-Assay in der primären und sekundären MLR gemessen. Proliferation ist an Tag 4, 5 und 6 gemessen, nachdem die primäre MLR Platten aufgebaut und sind an Tag 3, 5 und 7 nach der Secondary MLR Platten sind eingerichtet.</li><li> 1mCi von Tritium-Thymidin wird in die Vertiefungen 16 Stunden vor der Ernte aufgenommen</li><li> Nach der Zugabe von Tritium-Thymidin wird die Platte für eine further16 Stunden, dann auf eine Filtermatte mit einer Tomtec Mähdrescher (oder ähnlich) geerntet inkubiert. Der Luft trocknen die Filtermatte für eine Stunde dann in einen Beutel, 5 ml Szintillationsflüssigkeit und Dichtung. Lesen Sie die Platte in einem Wallac Micro beta Szintillationszähler oder ähnliches.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Die Berechnung der Wirksamkeit von Co-stimulatorische Blockade in der primären MLR</p><ol><li> Die prozentuale Hemmung (PI) der primären alloresponses als 100 berechnet x [Mittelwert cpm in allostimulation Brunnen (bulk alloanergy Co-Kultur PBMC) – Mittelwert cpm in allostimulation Brunnen (bulk Kontrolle Co-Kultur PBMC)}<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" ></ol><p class="jove_title"> 9. Die Berechnung der Wirksamkeit von Alloanergization in den sekundären MLR</p><p class="jove_content"> Die PI von sekundären alloresponses wird wie folgt berechnet<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" ><p class="jove_title"> 10. Die Berechnung der Spezifität der Alloanergization in den sekundären MLR</p><ol><li> Nach Restimulation der Zellen mit CD3-und CD28, kann TP allostimulators oder CMV-Antigen, das PI der Reaktionen auf diese Reize auch mit Hilfe dieser Formel werden. Das gibt ein Maß für die Spezifität der alloanergization Prozess</li></ol><p class="jove_title"> 11. Generieren Alloanergized Donor PBMC für den klinischen Einsatz nach einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT)</p><ol><li> Alloanergized Spender PBMC kann für den klinischen Gebrauch nach HLA-übereinstimmenden allogene Stammzelltransplantation unter Verwendung des Protokolls oben skizzierten erzeugt werden</li><li> Bei der Generierung von Zellen für die klinische Anwendung, Responder PBMC aus der HSCT Spender und Stimulator PBMC aus der HSCT Empfänger vor der Transplantation erhalten.</li><li> Bei der Generierung von PBMC für den klinischen Einsatz, alle Schritte werden unter Good Manufacturing Prozessbedingungen in akkreditierten Stammzell-Verarbeitungsanlagen durchgeführt.</li><li> Zusätzliche Qualitätskontrolle Assays sind auch Endotoxin-Assays und Gramfärbung und Kultur Sicherheitskriterien vor der Veröffentlichung von Zellen zu treffen für den klinischen Einsatz durchgeführt</li></ol><p class="jove_title"> 12. Repräsentative Ergebnisse</p><p class="jove_content"> Mit HLA-übereinstimmenden Stimulator und Responder PBMC, die Anwesenheit von kostimulatorischen Blockade in der primären MLR reduziert bedeuten alloproliferation der Responder PBMC an Tag 5 bis ca. 30% (+ / – 10%, Mittelwert + / – Standardabweichung), die gesehen in Kontrolle primäre MLR in Abwesenheit des kostimulatorischen Blockade. Dies entspricht einer mittleren Hemmung der primären alloproliferation von rund 70% (+ / – 10%) bei D5,<strong> Abbildung 1 A und B</strong>.</p><p class="jove_content"> In der sekundären MLR an Tag 5, FP alloproliferation von alloanergized PBMC in der Regel 10-15% (+ / – 10%), die mit Kontroll-PBMC entspricht einer mittleren Hemmung der Proliferation von 85-90% (sehen + / – 10 %),<strong> Abbildung 2A und B</strong>. Dies zeigt, dass alloanergized PBMC hyporesponsive zu FP allostimulators sind.</p><p class="jove_content"> Im Gegensatz alloanergized PBMC behalten typischerweise 70-100% ihrer Verbreitung auf Mitogene (CD3/CD28 Antikörper), TP allostimulators und CMV-Lysat (in CMV-reaktive Geber). Dies zeigt, dass hyporesponsive von alloanergized PBMC ist spezifisch für FP Alloantigene.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Abbildung 1. A.</strong> Proliferation (bestimmt durch Thymidin) in einer primären gemischten Lymphozyten-Reaktion mit HLA-übereinstimmenden Stimulator und Responder peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) in Abwesenheit oder Anwesenheit von kostimulatorischen Blockade mit humanisierten monoklonalen anti-B7.1 und B7.2- Antikörper. Die Ergebnisse werden als Mittelwert (+ /-SD) für 8 repräsentativen Experimenten unter Verwendung der einzigartigen Stimulator-Responder-Paare dargestellt.<strong> B</strong>. Prozentuale Hemmung der alloproliferation in primäre MLR in Anwesenheit von kostimulatorischen Blockade mit humanisierten monoklonalen anti-B7.1 und B7.2-Antikörper durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert (+ /-SD) für den gleichen 8 einzigartige Stimulator-Responder-Paare in Abbildung 1A dargestellt gezeigt.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Abbildung 2. A.</strong> Proliferation (bestimmt durch Thymidin) in sekundäre MLR, wo Responder PBMC aus primären MLR in Abwesenheit (Kontrolle PBMC) oder die Anwesenheit von kostimulatorischen Blockade (alloanergized PBMC) durchgeführt mit bestrahlten erste Partei Stimulatoren restimuliert sind. Die Ergebnisse werden als Mittelwert (+ /-SD) für die 8 einzigartige Stimulator-Responder-Paare in Abbildung 1 dargestellt angezeigt.<strong> B</strong>. Prozentuale Hemmung der First Party alloproliferation in sekundäre MLR, wo Responder PBMC aus primären MLR in Abwesenheit (Kontrolle PBMC) oder die Anwesenheit von kostimulatorischen Blockade (alloanergized PBMC) durchgeführt mit bestrahlten erste Partei Stimulatoren restimuliert sind. Die Ergebnisse werden als Mittelwert (+ /-SD) für die 8 einzigartige Stimulator-Responder-Paare in Abbildung 1 und Abbildung 2A dargestellt gezeigt.</p>