Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

1. Aislamiento de linfocitos CD4 + humanos células T de sangre periférica (ver Figura 1) Sangre venosa periférica (40 a 60 mL) se recoge en Vacutainer Tubos con heparina sódica (Becton Dickenson). La sangre periférica se transfiere desde el Vacutainer Tubos para tubos de 50 ml de poliestireno cónico (20 ml de sangre por tubo). RosetteSep CD4 + T-cell reactivo de aislamiento (StemCell Technologies) se añade un volumen de 1 ml a un máximo de 20 ml de sangre en un tubo de 50 ml y se mezcla bien. La mezcla se incuba a 20-25 ° C durante 20 minutos. Después de 20 minutos, calcio y magnesio-libre (CMF) tampón fosfato salino [PBS (HyClone] w / 2% inactivado por calor (56 ° C durante 30 minutos) de suero fetal bovino [FBS (HyClone)] se añade a la mezcla de con el fin de alcanzar un volumen final de 40 ml. Las mezclas diluidas (30 ml) luego en capas en la parte superior de 15 ml de medio de separación de linfocitos [LSM (Cellgro)] en fresco tubos de poliestireno cónico de 50 ml. Los tubos de 50 ml se centrifugan a 1200 x g durante 20 minutos con el freno de apagado. Los tubos de 50 ml se eliminan de la centrífuga con cuidado, para que la interfaz entre la LSM y medio no se altera. Las células en la interfase se recogen con una pipeta de 10 ml y se colocan en tubos de poliestireno fresco cónico de 50 ml. Las interfaces de recogida se diluyen con PBS FBS w / 2% hasta un volumen final de 50 ml. Los tubos de 50 ml que contienen las interfaces diluido se centrifugó a 1200 x g durante 10 minutos con el freno. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se aspiran y los pellets se resuspendieron en 10 ml de PBS w / FBS al 2%. Las suspensiones de células se combinan en un solo tubo de 50 ml y diluir a 50 ml con PBS w / FBS al 2%. El tubo que contiene la suspensión celular combinado se centrifuga a 300 x g durante 10 minutos para eliminar todo resto de LSM. El sobrenadante se aspira y el sedimento se resuspende entonces en 10 ml de medio RPMI-1640 (HyClone), que contiene 10% de SFB, 100 U / ml de penicilina, 100 mcg / ml de estreptomicina (HyClone) y 2 mM de L-glutamina (CellGro ) (RPMI-completa) y contó con un hemocitómetro. La concentración de agua purificada CD4 + T-Cells se ajusta a 3×10 6 / ml en RPMI-completo. CD4 + 's entonces se estimula mediante el cultivo con anti-CD3/anti-CD28 junto a los granos [de células T Expansion Kit (Miltenyi Biotec)] en una relación de tres cuentas por celda durante 72 horas a 37 ° C en un 5% C0 2 humidificado incubadora. 2. La infección de las células CD4 + T-Cells por el VIH-1 (ver Figura 1) Suspensión de células que contienen CD4 + T-estimulado las células se extraen de la placa de cultivo y contó con un hemocitómetro. CD4 + células T (~ 2×10 6) se añaden a un tubo cónico de 15 ml para uso como control no infectados. El resto de las células CD4 + T de células suspensión se coloca en un tubo cónico de 50 ml para la infección. Los tubos que contienen el de células CD4 + T-suspensiones se centrifugan a 300 x g durante 10 minutos y el sobrenadante del cultivo se aspira. CD4 + T-estimulado células se resuspenden directamente en el líquido de cultivo que contienen viriones y spin-infectadas a 1200 x g durante 2 horas a 20-25 ° C 9. Por lo general se infectan células CD4 + células T en una multiplicidad de infección (MOI), de 5 de una cepa deficientes de replicación del VIH (por ejemplo, DHIV-3) o MOI una de 0,01 para un virus de replicación competente (por ejemplo, el VIH-1 NL4 / 3) . El volumen final no es importante, pero los tubos deben ser equilibrados para centrifugación. Polybrene (Santa Cruz) se añade al líquido de cultivo antes de la spinfection a una concentración final de 10 mcg / ml. Una vez finalizado el spinfection, sobrenadantes se eliminan y las células se resuspendieron a una densidad celular de 3×10 6 / ml en RPMI-completo suplementado con 100 U / mL de IL-2. Las células infectadas y no infectadas son la cultura durante 72 horas si un virus de replicación incompetente se usa para infectar a la célula o de 5-7 días, si un virus de replicación competente se utilizó para infectar las células. Los medios de comunicación debe ser cambiado cada 48 horas durante el cultivo. 3. El aislamiento de las células asesinas naturales de la sangre periférica Sangre venosa periférica (~ 100 ml) se obtiene de un mismo donante para aislar las células CD4 + células T en Vacutainer Tubos con heparina sódica (Becton Dickenson). La sangre se transfiere desde el Vacutainer Tubos en tubos de 50 ml cónicos en alícuotas de 20 ml. El Vacutainer Los tubos se lavan con 8 ml de solución salina CMF Hanks Balanced [HBSS (Hyclone)] y los lavados se transfieren a los 50 ml conicals containing los 20 ml de sangre periférica. El volumen resultante en cada Erlenmeyer de 50 ml a 35 ml. La sangre diluida se capas en la parte superior de 15 ml de LSM en un nuevo tubo de 50 ml y los tubos de centrifugado a 400 x g durante 30 minutos con el freno de apagado. Los tubos se retira cuidadosamente de la centrífuga y la interfaz resultante entre la LSM y medio se extrae de cada tubo con una pipeta de 10 ml y se colocan en tubos cónicos de 50 nuevos ml. Las suspensiones celulares se lavaron una vez con HBSS CMF (centrifugado a 400 x g durante 15 minutos con el freno). Después del primer lavado de los sobrenadantes se eliminan y los pellets resultantes se combinan en una única de 50 ml y se lava dos veces con HBSS CMF (se centrifuga a 30 x g durante 10 minutos con el freno) para eliminar todos los LSM restantes. Después del último lavado del pellet es resupended en 10 ml de solución amortiguadora de lisis ACK (150 mM NH 4 Cl, 1,0 mM KHCO3 y 0,1 mM EDTA pH 7,3) y se incuban a temperatura ambiente (20-25 ° C) durante 5 minutos. Este paso es necesario para eliminar los eritrocitos contaminantes de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Después de 10 min. 40 ml de PBS CMF se añade a la suspensión de células con el fin de detener la reacción de lisis. El tubo con la suspensión de células que contienen los eritrocitos PBMC y lisadas se centrifuga a 300 x g durante 10 minutos con el freno. Se elimina el sobrenadante y el sedimento se resuspende en 5 ml de PBS con un 2% de SFB y 2 mM EDTA y contó con un hemocitómetro. El asesinas naturales (células NK) se aíslan de la PBMC usando un kit de celda de aislamiento NK [selección humano negativo (Miltenyi Biotec)] de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El flujo a través de las columnas se recogen en tubos de 15 ml y los tubos se centrifugaron a 300 x g durante 10 minutos con el freno. Los sobrenadantes se eliminan y se resuspendieron los pellets. Los pellets se resuspendieron se combinan en un tubo en un volumen total de 1 ml de medio modificado de Iscove Dulbecco [IMDM (Gibco)] complementado con AB 10% + inactivado por calor (56 ° C durante 30 minutos) de suero humano (SA) y contó con una hemocitómetro. El volumen de la suspensión celular se ajusta con SA IMDM c/10% de modo que la densidad final de las células NK es 3×10 6 / mL. La suspensión de células se divide por la mitad. Un conjunto de células NK recibe 200 U / ml humana recombinante de interleucina-2. El otro conjunto de células que queda en medio sin tratamiento de citoquinas. Los cultivos de células NK se incuban durante la noche a 37 ° C CO, 5% 2 Las células resultantes NK son usados ​​como células efectoras, ya sea para un ensayo de desgranulación CD107a o ensayo de liberación de 51 Cr. 4. Purificación del VIH-1 las células infectadas (ver Figura 1) El líquido de cultivo que contienen las células infectadas se retiran de las placas y se centrifuga a 300 x g durante 10 minutos con el freno. El sobrenadante se aspira y los pellets se resuspendieron en 2 ml de PBS con un 2% de SFB y 2 mM EDTA y células contadas en un hemocitómetro. Las células infectadas que no contienen el VIH-1 son aisladas, lejos de los que tienen el virus, aprovechando el hecho de que el VIH-1 modula por CD4. Para este propósito Kit de aislamiento CD4 positivas (Invitrogen) se utiliza de acuerdo a las instrucciones del fabricante, con la excepción de que un uno-CD4 de cuentas por la proporción de células se utiliza. Tras la eliminación de las células CD4 + células T, las células muertas son eliminadas de la población de células que albergan el virus purificado utilizando un kit de eliminación de células muertas (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El flujo a través después de la eliminación de células muertas en las columnas se centrifuga a 300 x g durante 10 minutos con el freno. Se elimina el sobrenadante, los pellets se resuspendieron en 1 ml de RPMI-completo y las células se cuentan. Las células infectadas purificada ya están listas para ser usadas como objetivo en un ensayo de desgranulación CD107a o ensayo de liberación de 51 Cr. 5. CD107a ensayo de desgranulación (ver Figura 2) Las culturas de las células NK se retiran de las placas y la suspensión de células se contaron. Suspensiones de las células NK se centrifuga a 300 x g durante 10 minutos con el freno. Las células NK son resuspendidas en RPMI-completa y la concentración final ajustado a 10 6 células / ml. Las suspensiones celulares de los aislados infectados y no infectados células T generadas en los pasos anteriores se centrifuga a 300 x g durante 10 minutos con el freno. Sobrenadantes se eliminan y pellets se resuspendieron en RPMI-completa en 2×10 6 células / ml. K562 células se utilizan como positivas las células control de destino, ya que son altamente susceptibles a la lisis NK. Tque las células se centrifugan a 300 x g durante 10 minutos con el freno, sobrenadantes se eliminan y se resuspendieron en RPMI-pellets completo en 2×10 6 células / ml En un 96-V-fondo y la placa de 100 mcl de los objetivos y 100 efectores mcl se añaden a los pocillos. Un pozo con 100 efectores mcLof y 100 mcl de medio sin células diana será utilizado para fines no específicos de la degranulación de las células NK. A cada pocillo 10 mcLFITC-conjugado anti-CD107a (LVB), se añade. La placa se centrifuga a 20 x g durante 2 minutos con el freno. La placa de centrifugado se incuba durante 4 horas a 37 º C y 5% CO 2. Después de la incubación de la placa se centrifuga a 400 x g durante 5 minutos con el freno. Se elimina el sobrenadante del precipitado. Cada pozo se tiñen luego con el siguiente panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo en hielo durante 20 minutos en un total de 100 de amortiguación del flujo mcLof (PBS w / FBS al 2% y 0,1% NaN 3) anti-CD3/14/20 [Pacific Blue-conjugado (Biolegend)] anti-CD56 [APC (Biolegend)] Después de la incubación de 20 minutos, 200 mcl de buffer de flujo se añade a cada pocillo y la placa se centrifuga a 400 x g durante 5 minutos con el freno. El buffer de flujo es cuidadosamente aspiración de cada pocillo utilizando una pipeta de 2 ml de aspiración provista de una punta de micropipeta 200 mcl mientras se asegura de no perturbar el sedimento. Paso 15 y 16 se repiten una vez más. Los pellets se resuspendieron en 200 mcl de 1% de paraformaldehído en PBS CMF. Las suspensiones celulares se transfieren a los tubos de flujo. Volumen total se lleva hasta 300 mcl mediante la adición de ~ 100 mcl de paraformaldehído al 1% en el CMF PBS a cada tubo. Los eventos (2×10 4) correspondientes a las células NK son recogidos por un citómetro de flujo con la DIVA FACS (LVB) para la adquisición de software y se analizaron usando el software de flujo de Jo (TreeStar). 6. CD107a estrategia de apertura de puerta (ver figura 3) Puertas de una sola célula se crean con una altura de dispersión frontal (FSC-H) de ancho frente a dispersión frontal (FSC-W) parcela. De parcela frente a la granularidad una dispersión FSC vs lateral (SSC) trama se crea en la puerta de células individuales. Normalmente, los linfocitos tienen granularidad relativamente bajo y mediano tamaño de la celda. Las células en la puerta de linfocitos se trazan en un gráfico de puntos de CD3/14/20 células teñidas vs CD56 células teñidas a la puerta de las células NK, omitiendo los monocitos (CD14), las células T (CD3) y de células B ( CD20). La población CD56 pos cerrada es evaluada con respecto CD107a. Las células NK, sin grupo de blancos se utiliza para establecer las puertas para lo que se considera CD107a negativo. 7. 51 Cr liberación de ensayo (ver Figura 4) Las células infectadas objetivo se marcan con 125 MCCI 51 Cr (Perkin Elmer) en saline/10 6 células durante 2 horas en un total de 500 mcl a 37 ° C y 5% de CO 2. Como control positivo 10 6 células K562 se etiquetan con 100 MCCI 51 Cr durante 2 horas en un total de 500 mcl a 37 ° C y 5% de CO 2. El volumen total se lleva hasta 500 mcl con RPMI-completo. El volumen de 51 Cr añadido a las células diana se calcula aquí: (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator) Mientras que las células diana son el etiquetado, previamente aisladas células NK son removidos de la cultura y contados. Los cultivos de células que contienen las células NK se centrifuga a 300 x g durante 10 minutos con los frenos. Gránulos que contienen las células NK son resuspendidas en RPMI-completo y se divide en tres tubos. La densidad celular se ajusta a 10 5 / ml en un tubo, 2.5×10 5 / ml en el segundo tubo y 5×10 5 / ml en el tercer tubo. Células marcadas con los objetivos son retirados de la incubadora y 4,5 ml de RPMI-completa se añade a cada tubo. Tubos se centrifugaron a 300 x gf o 10 minutos. Sobrenadante se vierte con cuidado de no perturbar el precipitado en un recipiente para residuos líquidos radiactivos. Los pasos 4 y 5 se repiten dos veces más para eliminar todas las absorbido 51 Cr. Sobrenadantes del tercer lavado se pueden eliminar en un contenedor para residuos no radiactivos líquidos. Los objetivos marcados son luego resuspendido en RPMI-completa a una densidad celular final de 10 5 / ml. 100 mcl de los objetivos marcados que se distribuyan en los pozos de una placa de 96-V-parte inferior y para un número final de células de 10 4 células diana / bien. Tabla 1 es un ejemplo de una configuración típica de un ensayo de liberación de 51 Cr. Cada grupo se hace por triplicado. 1 2 <td> 3 4 5 6 7 8 9 A K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (5:1) K562 E: T (5:1) K562 E: T (5:1) B IU E: T (1:1) IU E: T (1:1) IU E: T (1:1) IU E: T (2,5:1) IU E: T (2,5:1) IU E: T (2,5:1) IU E: T (5:1) IU E: T (5:1) IU E: T (5:1) C VIH-1 E Infectados: T (1:1) VIH-1 E Infectados: T (1:1) VIH-1 E Infectados: T (1:1) VIH-1 E Infectados: T (2,5:1) VIH-1 E Infectados: T (2,5:1) VIH-1 E Infectados: T (2,5:1) VIH-1 E Infectados: T (1:1) VIH-1 E Infectados: T (1:1) VIH-1 E Infectados: T (1:1) D E F K562 liberación espontánea K562 liberación espontánea K562 liberación espontánea IU liberación espontánea IU liberación espontánea IU liberación espontánea VIH-1 en la liberación espontánea infectados VIH-1 en la liberación espontánea infectados VIH-1 en la liberación espontánea infectados G K562 liberación máxima K562 liberación máxima K562 liberación máxima IU máxima de lanzamiento IU máxima de lanzamiento IU máxima de lanzamiento VIH-1 Release carge infectados VIH-1 Release carge infectados VIH-1 Release carge infectados 100 mcl de las suspensiones de células NK por encima se añaden a cada pocillo que contiene las células diana. 100 mcl de los objetivos se añaden a los pocillos correspondientes en el que las células efectoras están ausentes de los grupos de liberación máxima y espontánea. El grupo de liberación espontánea se incuba con un adicional de 100 mcl de RPMI-completo. La placa de 96 pocillos se centrifuga a 20 x g durante 2 minutos con el freno. La placa de centrifugado se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 4 horas. Después de las 4 horas de incubación de 5 mcl de una dilución 1:10 de los glóbulos rojos humanos en medio RPMI-completa se añade a cada pocillo, excepto los pozos de liberación máxima. 100 mcl de sulfato de sodio al 10% de dodecil se añade a los pozos de liberación máxima. La placa se centrifugó a 400 x g durante 5 minutos para que sedimenten las células. 100 mcl de sobrenadante libre de células se extrae de cada pozo y se colocan en distintas contador gamma tubos (Perkin Elmer). Los tubos se colocan en un contador gamma automático 2470 (Perkin Elmer). La cantidad de 51 Cr presentes en el líquido de la cultura se mide como cuentas por minuto de la media de una lectura de 2 minutos. Lecturas de cuentas por minuto (CPM) de las muestras y los controles se utilizan para calcular el% de lisis específica mediante la siguiente ecuación: [(Experimental CPM – promedio de CPM espontánea) / (media de CPM máximo – media espontánea CPM)] x 100 8. Los resultados representativos: Figura 1. Pasos a seguir en el aislamiento de las células asesinas naturales y la generación de VIH-1 en las células diana infectadas de la sangre periférica. Figura 2. Pasos a seguir en la construcción de un ensayo de desgranulación CD107a utilizando células NK como efectores y células K562, CD4 + no infectadas y las células T infectadas por VIH-1 las células T como objetivos. Figura 3. Citometría de flujo gating estrategia para un ensayo de desgranulación CD107a. (A) de apertura de puerta en las células individuales y grupos excluir o dobletes en una parcela de FSC-A (área de dispersión hacia adelante) vs FSC-H (altura de dispersión hacia adelante). (B) puerta de la celda individual representa como FSC-A vs SSC (dispersión lateral) gating en la población de linfocitos. (C) de linfocitos representan como CD3/14/20(Células T, monocitos, células B) vs CD56 (células NK) gating en el CD56 pos andCD3/14/20 población neg (NK puerta). (D) NK puerta representa como CD107a vs CD56 para visualizar las células NK que tienen degranulados (CD107a pos). Figura 4. Pasos necesarios para la construcción de un ensayo de liberación de 51 Cr utilizando células NK como efectores y células K562, CD4 + no infectadas y las células T infectadas por VIH-1 las células T como objetivos. Figura 5. Los resultados representativos para evaluar la respuesta citotóxica de las células asesinas naturales contra el VIH-1 las células infectadas. (A) las células NK fueron evaluados por su capacidad de degranulación sin objetivos y en respuesta a las células K562, CD4 primaria + células T y la infección por VIH primaria de células T según lo evaluado por el porcentaje de células NK que expresan CD107a superficie. Los números en cada cuadrante representa el porcentaje del total de las células NK. B) Las células NK son evaluados por su capacidad para lisar las células K562, CD4 + no infectadas de las células T y de VIH-1 las células T en un ensayo de liberación de 51 Cr en la célula efectora diferentes proporciones de células objetivo (E: T).