Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays

1. Isolatie van de Mens CD4 + T-cellen uit perifeer bloed (zie figuur 1) Perifere veneuze bloed (40 tot 60 ml) wordt verzameld in Vacutainer Buizen met natrium-heparine (Becton Dickenson). Het perifeer bloed wordt dan overgebracht van de Vacutainer Buizen naar 50 ml polystyreen conische buizen (20 ml bloed per buis). RosetteSep CD4 + T-cel isolatie reagens (StemCell Technologies) is toegevoegd in een 1 ml volume niet meer dan 20 ml bloed in een 50 ml buis en goed gemengd. Het mengsel wordt vervolgens geïncubeerd bij 20-25 ° C gedurende 20 minuten. Na 20 minuten, calcium en magnesium-vrij (CMF) fosfaat-gebufferde zoutoplossing [PBS (Hyclone] w / 2% hitte-geïnactiveerd (56 ° C gedurende 30 minuten) foetaal runderserum [FBS (Hyclone)] is toegevoegd aan de mengsels om tot een uiteindelijk volume van 40 ml te bereiken. De verdunde mengsels (30 ml) worden vervolgens lagen op de top van 15 ml Lymfocyt Scheiding Medium [LSM (Cellgro)] in verse 50 ml polystyreen conische buizen. De 50 ml buisjes worden vervolgens gecentrifugeerd bij 1200 x g gedurende 20 minuten met de rem af. De 50 ml buisjes worden verwijderd uit de centrifuge voorzichtig, zodat de interface tussen de LSM en medium niet wordt verstoord. De cellen op het grensvlak worden verzameld met een 10 ml pipet en geplaatst in vers 50 ml polystyreen conische buizen. De verzamelde interfaces zijn verdund met PBS w / 2% FBS tot een uiteindelijk volume van 50 ml. De 50 ml buisjes met de verdunde interfaces worden gecentrifugeerd bij 1200 x g gedurende 10 minuten met de rem op. Na het centrifugeren, worden de supernatanten afgezogen en de pellets opnieuw gesuspendeerd in 10 ml PBS w / 2% FBS. De celsuspensies worden vervolgens gecombineerd tot een enkele 50 ml conische buis en verdund tot 50 ml met PBS w / 2% FBS. De buis met daarin het gecombineerde celsuspensie wordt gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten om alle resterende LSM te verwijderen. Het supernatant wordt afgezogen en de pellet wordt vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 10 ml van RPMI-1640 medium (Hyclone) met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 mcg / ml streptomycine (Hyclone) en 2 mM L-glutamine (CellGro ) (RPMI-complete) en geteld met behulp van een hemocytometer. De concentratie van gezuiverde CD4 + T-cellen wordt dan aangepast aan de 3×10 6 / mL met RPMI-compleet. CD4 + 's worden vervolgens gestimuleerd door het kweken van hen met anti-CD3/anti-CD28 gekoppeld aan kralen [T-cel Expansion Kit (Miltenyi Biotec)] op een drie kralen per cel ratio voor 72 uur bij 37 ° C in een 5% C0 2 bevochtigde incubator. 2. Infectie van CD4 + T-cellen met HIV-1 (zie figuur 1) Celsuspensie met gestimuleerd CD4 + T-cellen worden verwijderd uit de cultuur plaat en geteld met behulp van een hemocytometer. CD4 + T-cellen (~ 2×10 6) worden toegevoegd aan een 15 ml conische buis voor gebruik als een niet-geïnfecteerde controle. De rest van de CD4 + T-cel suspensie wordt geplaatst in een 50 ml conische buis voor de infectie. De buizen die de CD4 + T-cel suspensies worden gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten en de cultuur supernatant wordt afgezogen. Gestimuleerd CD4 + T-cellen zijn direct geresuspendeerd in cultuur vloeistoffen met virionen en dan spin-geïnfecteerd op 1200 x g gedurende 2 uur bij 20-25 ° C 9. Typisch we besmetten CD4 + T-cellen bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 5 voor een replicatie-deficiënte HIV-stam (bijv. DHIV-3) of een MOI van 0,01 voor een replicatie-competent virus (bijvoorbeeld HIV-1 NL4 / 3) . Eindvolume is onbelangrijk, maar buizen moeten worden afgewogen voor centrifugeren. Polybreen (Santa Cruz) wordt toegevoegd aan de kweekvloeistof voorafgaand aan de spinfection bij een uiteindelijke concentratie van 10 mcg / ml. Na voltooiing van de spinfection, worden de supernatanten verwijderd en cellen geresuspendeerd in een cel dichtheid van 3×10 6 / ml in RPMI-compleet aangevuld met 100 U / ml IL-2. De geïnfecteerde niet-geïnfecteerde cellen zijn cultuur voor 72 uur als een replicatie incompetent virus werd gebruikt om de cel of 5-7 dagen als een replicatie-competent virus werd gebruikt om de cellen te infecteren infecteren. De media moeten worden vervangen elke 48 uur tijdens de cultuur. 3. Isolatie van de Mens Natural Killer-cellen uit het perifere bloed Perifere veneuze bloed (~ 100 ml) wordt verzameld van dezelfde donor gebruikt worden om de CD4 + T-cellen te isoleren in de Vacutainer Buizen met natrium-heparine (Becton Dickenson). Het bloed wordt dan overgebracht van de Vacutainer Buizen in 50 ml conische buizen in 20 ml porties. De Vacutainer Buizen worden vervolgens gewassen met 8 ml CMF Hanks Balanced Salt Solution [HBSS (Hyclone)] en het wast worden overgebracht naar de 50 ml conicals containing van de 20 ml van perifere bloed. De resulterende volume in elke 50 ml conische is 35 ml. De verdunde bloed wordt dan lagen op de top van 15 ml van LSM in een verse 50 ml conische buis en de buizen gecentrifugeerd bij 400 x g gedurende 30 minuten met de rem af. De buizen worden zorgvuldig verwijderd uit de centrifuge en de daaruit voortvloeiende interface tussen de LSM en medium wordt geoogst van elk buisje met behulp van een pipet van 10 ml en geplaatst in vers 50 ml conische buizen. De celsuspensies worden eenmaal gewassen met CMF HBSS (gecentrifugeerd bij 400 x g gedurende 15 minuten met de rem op). Na de eerste wasbeurt van de bovenstaande vloeistoffen worden verwijderd en de resulterende pellets worden gecombineerd in een enkele 50 ml conische en tweemaal gewassen met CMF HBSS (gecentrifugeerd bij 30 x g gedurende 10 minuten met de rem op) om alle resterende LSM te verwijderen. Na de laatste wasbeurt de pellet is resupended in 10 ml ACK lysis buffer (150 mM NH 4 Cl, 1,0 mM KHCO 3 en 0,1 mM EDTA pH 7,3) en geïncubeerd bij kamertemperatuur (20-25 ° C) gedurende 5 minuten. Deze stap is noodzakelijk om aan besmettelijke erytrocyten te verwijderen uit het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). Na 10 minuten. 40 ml van de CMF PBS wordt toegevoegd aan de celsuspensie in om de lysis reactie te stoppen. De buis met de celsuspensie met de PBMC en gelyseerd erytrocyten wordt vervolgens gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten met de rem op. Het supernatant wordt verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd in 5 ml PBS met 2% FBS en 2 mM EDTA en geteld met behulp van een hemocytometer. De natural killer (NK) cellen worden vervolgens geïsoleerd van de PBMC met behulp van een NK Cell Isolation Kit [negatieve selectie-menselijke (Miltenyi Biotec)] volgens de instructies van de fabrikant. De doorstroom van de kolommen worden verzameld in 15 ml buizen en de buizen gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten met de rem op. De supernatant verwijderd en de pellets geresuspendeerd. De geresuspendeerde pellets zijn gecombineerd in een buis in een totaal volume van 1 ml medium Iscove's gemodificeerd Dulbecco's [IMDM (Gibco)] aangevuld met 10% AB + warmte geïnactiveerd (56 ° C gedurende 30 minuten) menselijk serum (HS) en geteld met een hemacytometer. Het volume van de celsuspensie wordt aangepast met IMDM W/10% HS zodat de uiteindelijke dichtheid van NK-cellen is 3×10 6 / mL. De celsuspensie wordt in tweeën verdeeld. Een set van NK-cellen ontvangt 200 U / ml recombinant humaan interleukine-2. De andere set van cellen is nog in medium zonder cytokine behandeling. De NK-cel culturen worden vervolgens gedurende de nacht geïncubeerd bij 37 ° C, 5% CO 2 De resulterende NK-cellen worden dan gebruikt als effector cellen voor ofwel een CD107a degranulatie assay of 51 Cr afgifte test. 4. Zuivering van HIV-1 geïnfecteerde cellen (zie figuur 1) De cultuur vloeistoffen met geïnfecteerde cellen worden verwijderd uit de platen en gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten met de rem op. Het supernatant wordt afgezogen en de pellets zijn geresuspendeerd in 2 ml PBS met 2% FBS en 2 mM EDTA en cellen geteld op een hemocytometer. Geïnfecteerde cellen die geen HIV-1 weg zijn geïsoleerd van degenen die het virus haven door gebruik te maken van het feit dat HIV-1 naar beneden CD4 moduleert. Voor dit doel CD4-positieve Isolation Kit (Invitrogen) wordt gebruikt volgens de instructies van de fabrikant met die uitzondering dat een een-CD4 kraal per cel-ratio wordt gebruikt. Na het verwijderen van de CD4 + T-cellen, worden de dode cellen verwijderd uit het gezuiverde celpopulatie herbergen het virus met behulp van een Dead Cell Removal Kit (Miltenyi Biotec) volgens de instructies van de fabrikant. De stroom-door het volgen van dode cellen verwijderen van de in de kolommen wordt gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten met de rem op. Het supernatant wordt verwijderd, pellets geresuspendeerd in 1 ml RPMI-compleet en de cellen worden geteld. De gezuiverde geïnfecteerde cellen zijn nu klaar voor gebruik als doelen in een CD107a degranulatie assay of 51 Cr afgifte test. 5. CD107a degranulatie Assay (zie figuur 2) NK celculturen worden verwijderd uit platen en de celsuspensie wordt geteld. NK celsuspensies worden gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten met de rem op. NK-cellen worden opnieuw gesuspendeerd in RPMI-voltooid en de uiteindelijke concentratie ingesteld op 10 6 cellen / ml. Celsuspensies van de geïsoleerde geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde T-cellen gegenereerd in de bovenstaande stappen worden gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten met de rem op. Supernatant verwijderd en pellets opnieuw gesuspendeerd in RPMI-volledig op 2×10 6 cellen / ml. K562-cellen worden gebruikt als positieve controle doelcellen, omdat ze zeer gevoelig zijn voor NK lysis. THij cellen worden gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten met de rem op, worden de supernatanten verwijderd en pellets opnieuw gesuspendeerd in RPMI-volledig op 2×10 6 cellen / ml In een 96-V-vormige putjes plaat 100 mcl van doelen en 100 mcl effectoren worden toegevoegd aan de wells. Een goed met 100 mcLof effectoren en 100 mcl van medium zonder target-cellen zal worden gebruikt voor niet-specifieke NK celdegranulatie. Aan elk putje 10 mcLFITC-geconjugeerd anti-CD107a (BDIS) wordt toegevoegd. De plaat wordt daarna gecentrifugeerd bij 20 x g gedurende 2 minuten met de rem op. De gecentrifugeerd plaat wordt gedurende 4 uur bij 37 ° C en 5% CO 2. Na incubatie wordt de plaat gecentrifugeerd bij 400 x g gedurende 5 minuten met de rem op. Het supernatant wordt verwijderd uit de pellet. Elke well wordt vervolgens gekleurd met de volgende panel van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen op ijs gedurende 20 minuten in een totaal van 100 mcLof stroom buffer (PBS w / 2% FBS en 0,1% NaN 3) anti-CD3/14/20 [Pacific Blue-geconjugeerde (Biolegend)] anti-CD56 [APC (Biolegend)] Na de 20 minuten incubatie, is 200 mcl van flow buffer aan elk putje toegevoegd en de plaat wordt gecentrifugeerd bij 400 x g gedurende 5 minuten met de rem op. De stroom buffer wordt vervolgens zorgvuldig opgezogen uit elk putje met behulp van een 2 mL pipet opzuigen uitgerust met een 200 mcl micropipet tip terwijl het zeker niet om de pellet te verstoren. Stap 15 en 16 zijn nog eens herhaald. Pellets zijn geresuspendeerd in 200 mcl van 1% paraformaldehyde in CMF PBS. De celsuspensies worden vervolgens overgebracht te stromen buizen. Het totale volume wordt gebracht tot 300 mcl door het toevoegen van ~ 100 mcl van 1% paraformaldehyde in CMF PBS aan elke buis. De gebeurtenissen (2×10 4) voor NK-cellen worden verzameld door een flowcytometer met behulp van de FACS DIVA (BDIS) software voor de acquisitie en geanalyseerd met behulp van Flow Jo software (TreeStar). 6. CD107a Gating Strategie (zie figuur 3) Eencellige poorten zijn gemaakt met behulp van een forward scatter hoogte (FSC-H) vs voorwaartse verstrooiing breedte (FSC-W) plot. Voor maat versus granulariteit perceel een FSC-versus zijwaartse verstrooiing (SSC) plot is gemaakt op de enkele cel poort. Typisch lymfocyten hebben een relatief lage granulariteit en medium celgrootte. De cellen in de lymfocyt gate worden vervolgens uitgezet in een dot plot van CD3/14/20 gekleurde cellen ten opzichte van CD56 gekleurde cellen aan hek aan de NK-cellen en het weglaten van monocyten (CD14), T-cellen (CD3) en B-cellen ( CD20). De CD56 pos gated bevolking wordt vervolgens geëvalueerd op CD107a. De NK-cellen zonder targets groep wordt gebruikt om de poorten te stellen voor wat wordt beschouwd als CD107a negatief. 7. 51 Cr Laat Assay (zie figuur 4) Geïnfecteerde doelcellen zijn gelabeld met 125 MCCI 51 Cr (Perkin Elmer) in saline/10 6 cellen voor 2 uur in een totaal van 500 mcl bij 37 ° C en 5% CO 2. Als een positieve controle 10 6 K562 cellen zijn voorzien van de 100 MCCI 51 Cr gedurende 2 uur in een totaal van 500 mcl bij 37 ° C en 5% CO 2. Het totale volume wordt gebracht tot 500 mcl met RPMI-compleet. Het volume van 51 Cr toegevoegd aan de doelcellen wordt hier berekend: (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator) Terwijl de doelcellen zijn etikettering, zijn voorheen geïsoleerde NK-cellen verwijderd uit de cultuur en geteld. Celculturen met NK-cellen worden gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten met de remmen op. Pellets met een NK-cellen worden opnieuw gesuspendeerd in RPMI-complete en opgesplitst in 3 buizen. De cel dichtheid wordt aangepast aan 10 5 / ml in een buis, 2.5×10 5 / ml in de tweede buis en 5×10 5 / ml in de derde buis. Gelabelde targets cellen worden verwijderd uit de incubator en 4,5 ml RPMI-compleet is toegevoegd aan elke buis. Buisjes worden vervolgens gecentrifugeerd bij 300 x gf of 10 minuten. Supernatant afgegoten zorgvuldig niet om de pellet te verstoren in een container voor radioactief vloeibaar afval. Stap 4 en 5 worden herhaald twee keer meer om alle niet-geabsorbeerde 51 Cr te verwijderen. Supernatanten van de derde maal kan worden afgevoerd in een container voor niet-radioactief vloeibaar afval. Gelabeld doelstellingen zijn vervolgens opnieuw gesuspendeerd in RPMI-compleet tot een uiteindelijke celdichtheid van 10 5 / ml. 100 mcl van gelabelde doelstellingen zijn in hoeveelheden verdeeld in wells van een 96-V-bodem en plaat voor een laatste cel aantal van 10 4 target-cellen / well. Tabel 1 is een voorbeeld van een typische setup voor een 51 Cr afgifte test. Elke groep wordt gedaan in drievoud. 1 2 <td> 3 4 5 6 7 8 9 Een K562 E: T (01:01) K562 E: T (01:01) K562 E: T (01:01) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (05:01) K562 E: T (05:01) K562 E: T (05:01) B UI E: T (01:01) UI E: T (01:01) UI E: T (01:01) UI E: T (2,5:1) UI E: T (2,5:1) UI E: T (2,5:1) UI E: T (05:01) UI E: T (05:01) UI E: T (05:01) C HIV-1 geïnfecteerde E: T (01:01) HIV-1 geïnfecteerde E: T (01:01) HIV-1 geïnfecteerde E: T (01:01) HIV-1 geïnfecteerde E: T (2,5:1) HIV-1 geïnfecteerde E: T (2,5:1) HIV-1 geïnfecteerde E: T (2,5:1) HIV-1 geïnfecteerde E: T (01:01) HIV-1 geïnfecteerde E: T (01:01) HIV-1 geïnfecteerde E: T (01:01) D E F K562 Spontane release K562 Spontane release K562 Spontane release UI Spontane release UI Spontane release UI Spontane release HIV-1 geïnfecteerde Spontaneous Release HIV-1 geïnfecteerde Spontaneous Release HIV-1 geïnfecteerde Spontaneous Release G K562 vrijkomen van de grootst K562 vrijkomen van de grootst K562 vrijkomen van de grootst UI vrijkomen van de grootst UI vrijkomen van de grootst UI vrijkomen van de grootst HIV-1 geïnfecteerde Maxmum release HIV-1 geïnfecteerde Maxmum release HIV-1 geïnfecteerde Maxmum release 100 mcl van de bovenstaande NK celsuspensies worden toegevoegd aan elk putje met doelcellen. 100 mcl van doelen worden toegevoegd aan overeenkomstige putten in die effector cellen afwezig zijn voor de maximale en spontane release groepen. De spontane versie groep is geïncubeerd met een extra 100 mcl van RPMI-complete. De 96-well plaat gecentrifugeerd bij 20 x g gedurende 2 minuten met de rem op. De plaat wordt vervolgens gecentrifugeerd geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 4 uur. Na de 4-uur incubatie 5 mcl van een 1:10 verdunning van menselijke rode bloedcellen in RPMI-compleet wordt toegevoegd aan elk putje met uitzondering van het vrijkomen van de grootst putten. 100 mcl van 10% natriumdodecylsulfaat wordt toegevoegd aan het vrijkomen van de grootst putten. De plaat wordt gecentrifugeerd bij 400 x g gedurende 5 minuten om pellet de cellen. 100 mcl van cel-vrije supernatant wordt geoogst uit elk putje en geplaatst in aparte gamma-counter-buizen (Perkin Elmer). De buizen worden geplaatst in een 2470 Automatic Gamma Counter (Perkin Elmer). De hoeveelheid van 51 Cr aanwezig is in de kweekvloeistof wordt gemeten als tellingen per minuut van het gemiddelde van een 2-minuten lezen. Tellingen per minuut (CPM) metingen van de monsters en controles worden gebruikt om de specifieke lysis% berekenen met behulp van de volgende vergelijking: [(Experimentele CPM – gemiddelde van spontane CPM) / (gemiddelde van maximum CPM – gemiddelde spontane CPM)] x 100 8. Representatieve resultaten: Figuur 1. Stappen die betrokken zijn bij het ​​isoleren van natural killer cellen en het genereren van HIV-1 geïnfecteerde target cellen uit het perifere bloed. Figuur 2. Stappen betrokken bij de bouw van een CD107a degranulatie test gebruik te maken van NK-cellen als effectoren en K562 cellen, niet-geïnfecteerde CD4 + T-cellen en HIV-1 geïnfecteerde T-cellen als doelwit. Figuur 3. Flowcytometrie-gating-strategie voor een CD107a degranulatie assay. (A) Poortsignalen op enkele cellen en met uitzondering van klonten of doubletten op een perceel van FSC-A (forward scatter gebied) vs FSC-H (forward scatter hoogte). (B) Single-cel poort uitgezet als FSC-A vs SSC (zijwaartse verstrooiing) gating op de lymfocyten bevolking. (C) Lymfocyt poort uitgezet als CD3/14/20(T-cellen, monocyten, B-cellen) vs CD56 (NK-cellen) gating op de CD56 pos andCD3/14/20 neg bevolking (NK gate). (D) NK gate geplot als CD107a vs CD56 om NK-cellen die zijn degranulated (CD107a pos) te visualiseren. Figuur 4. Stappen betrokken bij de bouw van een 51 Cr afgifte test gebruik te maken van NK-cellen als effectoren en K562 cellen, niet-geïnfecteerde CD4 + T-cellen en HIV-1 geïnfecteerde T-cellen als doelwit. Figuur 5. Representatieve resultaten voor de beoordeling van de cytotoxische respons van natural killer tegen HIV-1 geïnfecteerde cellen. (A) NK-cellen werden geëvalueerd op hun vermogen om degranuleren zonder doelen en in reactie op K562 cellen, primaire CD4 + T-cellen en HIV geïnfecteerde primaire T-cellen zoals bepaald door het percentage van de NK-cellen die het oppervlak CD107a. De getallen in elk kwadrant vertegenwoordigen het percentage van de totale NK-cellen. B) NK-cellen worden beoordeeld op hun vermogen om K562 cellen, niet-geïnfecteerde CD4 + T-cel en HIV-1 geïnfecteerde T-cellen lyseren in een 51 Cr afgifte test op verschillende effector cel naar cel ratio's (E doel: T).