준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

1. 인간 CD4 + 주변 혈액에서 T 세포 (그림 1 참조)의 분리 주변 정맥 혈액 (40-60 MLS)는 Vacutainer으로 수집 헤파린 나트륨 (백톤 디컨슨)이있는 튜브. 주변 혈액은 다음 Vacutainer에서 전송 50 ML의 폴리스티렌 원뿔 튜브 (튜브 당 혈액의 20 ML)로 튜브. RosetteSep CD4 + T 세포 격리 시약 (StemCell 기술) 50 ML 튜브와 혼합 우물에 피를 더 이상 20 이상 ML에 1 ML 볼륨에 추가됩니다. 혼합물은 다음 20 분 동안 20-25 ° C에서 incubated입니다. 20 분 칼슘과 마그네슘이없는 (CMF)는 인산 버퍼 후 생리 [PBS (HyClone] W / 2퍼센트 열 inactivated (56 ° C 30 분) 태아 소 혈청 [FBS (HyClone)]에 추가됩니다 혼합 40 ML의 최종 볼륨을 달성하기 위해서. 희석 혼합 (30 ML)를 다음 림프구 분리 매체 15 ML 위에 계층은 [LSM (Cellgro)] 신선한 50 ML의 폴리스티렌 원뿔 튜브 인치 50 ML 튜브는 다음 브레이크에서 20 분 동안 1,200 X g에서 centrifuged 있습니다. 50 ML 튜브는 LSM와 매체 사이의 인터페이스가 방해되지 않도록 신중하게 원심에서 제거됩니다. 인터페이스에있는 세포는 10 ML 피펫과 수집 및 신선한 50 ML의 폴리스티렌 원뿔 튜브에 배치됩니다. 수집 인터페이스 50 ML의 최종 볼륨 PBS w / 2퍼센트 FBS로 희석하고 있습니다. 희석 인터페이스를 포함하는 50 ML 튜브에 브레이크와 함께 10 분 동안 1,200 X g에서 centrifuged 있습니다. 원심 분리 후, supernatants은 aspirated과 산탄 10 PBS w의 MLS / 2퍼센트 FBS에 resuspended 있습니다. 셀 suspensions 그런 다음 하나의 50 ML 원뿔 관에 결합하여 PBS w / 2퍼센트 FBS과 함께 50 MLS에 희석하고 있습니다. 통합 세포 현탁액을 포함하는 튜브는 남아있는 모든 LSM을 제거하는 10 분 동안 300 x g에서 centrifuged입니다. 뜨는은 aspirated되고 펠렛은 다음 10% FBS, 페니실린 100 U / ML, 스트렙토 마이신 100 mcg / ML (HyClone) 및 2 MM L – 글루타민 (CellGro이 포함된 RPMI – 1640 배지 10 MLS (HyClone)에 resuspended입니다 () RPMI 완성)과 hemocytometer를 사용하여 계산. CD4 + T 세포를 정화의 농도는 다음 3×10 RPMI – 완료와 함께 6 / ML하도록 조정됩니다. CD4는 +의 그 다음 culturing 비즈 [T – 세포 확장 키트 (Miltenyi Biotec)] 37 72 시간 동안 세포 비율 당 세 비즈 ° C 5 % C0 2 humidified시로 결합 anti-CD3/anti-CD28와 그들에 의해 자극된 상태네 인큐베이터. 2. CD4 + HIV – 1과 T – 세포 (그림 1 참조)의 감염 자극 CD4 + T 세포를 포함한 세포 현탁액은 문화 판에서 제거하고 hemocytometer를 사용하여 계산됩니다. CD4 + T – 세포 (~ 2×10 6) 감염되지 않은 컨트롤로 사용하기 위해 15 ML 원뿔 관에 추가됩니다. CD4의 나머지 부분 + T – 세포 현탁액은 감염 50 ML 원뿔 관에 배치됩니다. CD4 + T – 세포 suspensions은 10 분, 문화 뜨는 300 X g에서 centrifuged 아르를 포함하는 튜브가 aspirated입니다. 자극 CD4 + T 세포는 virions을 포함하는 문화 유체에 직접 resuspended 후 20-25 ° C 9시 2 시간 1,200 X g에서 스핀 – 감염됩니다. 일반적으로 우리는 복제 능력 바이러스에 대한 0.01의 복제 결함 HIV 스트레인 (예 : DHIV – 3) 또는 뫄 5의 감염의 다중성 (뫄)에서 CD4 + T – 세포를 감염 (예 : HIV – 1 NL4 / 3) . 최종 부피는 중요하지만, 튜브는 원심 분리에 대한 균형되어야합니다. Polybrene (산타 크루스는) 10 mcg / ML의 최종 농도에서 이전 spinfection하는 문화 유체에 추가됩니다. spinfection 완료되면, supernatants은 제거하고 세포는 100 U / ML IL – 2와 함께 보충 RPMI 완성에 3×10 6 / ML의 세포 밀도에 resuspended 있습니다. 복제 쓸모없는 바이러스가 세포 또는 복제 관할 바이러스가 세포를 감염하는 데 사용되는 경우 5-7일를 감염하는 데 사용된 경우 감염과 감염되지 않은 세포는 72 시간의 문화입니다. 미디어 문화 중 매 48 시간 변경해야합니다. 3. 주변 혈액에서 인간의 자연 킬러 세포 분리 주변 정맥 혈액 (~ 100 ML)는 Vacutainer에 CD4 + T – 세포를 분리하는 데 사용되는 같은 기증자로부터 수집 헤파린 나트륨 (백톤 디컨슨)이있는 튜브. 혈액은 다음 Vacutainer에서 전송 20 ML aliquots 50 ML 원뿔 튜브에 튜브. Vacutainer 튜브는 다음 CMF 행크스 밸런스드 소금 솔루션 [HBSS (Hyclone)] 8 ML로 씻은하고 세척이 50 ML conicals containi으로 전송됩니다NG 주변 혈액의 20 ML. 각 50 ML 원뿔의 결과 볼륨은 35 ML이다. 희석 혈액은 다음 15 신선 50 ML 원뿔 튜브 LSM의 ML과 브레이크에서 30 분 동안 400 X g에서 centrifuged 튜브 위에 계층입니다. 튜브는 신중하게 원심에서 제거되며 LSM와 매체 사이에 발생하는 인터페이스는 10 ML 피펫을 사용하여 각 튜브의 수확과 신선한 50 ML 원뿔 튜브에 배치됩니다. 셀 suspensions은 CMF HBSS (에 브레이크와 함께 15 분 동안 400 X g에서 centrifuged)로 한 번 세탁하고 있습니다. 첫 번째 세척 후 supernatants이 제거되고 결과 알약이 결합되어 하나의 원뿔 50 ML에 모든 나머지 LSM을 제거하는 CMF HBSS (에 브레이크와 함께 10 분 30 X g에서 centrifuged)로 두 번 씻어. 마지막 세척 후 펠렛은 ACK 용해 완충액 10 ML에 resupended입니다 (150 MM NH 4 Club 호텔을 1.0 MM KHCO 3 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 7.3)과 5 분에 대한 온도는 실온 (20-25 ° C)에서 incubated. 이 단계는 주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)에서 오염 적혈구를 제거하기 위해 필요합니다. 후 10 분. CMF PBS 40 ML은 용해 반응을 중지하기 위해 세포 현탁액에 추가됩니다. PBMC 및 lysed 적혈구를 포함하는 세포 현탁액을 가진 튜브 그런 다음에 브레이크와 함께 10 분 동안 300 x g에서 centrifuged입니다. 뜨는이 제거되고 펠렛은 2퍼센트 FBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 hemocytometer를 사용하여 집계와 PBS 5 ML에 resuspended 있습니다. 자연 킬러 (NK) 세포는 다음 [음성 선택 – 인간 (Miltenyi Biotec)] 제조 업체의 지침에 따라 NK 세포 격리 키트를 사용하여 PBMC에서 격리됩니다. 컬럼에서 통한 흐름은 15ml 튜브에 수집되고 튜브가에 브레이크와 함께 10 분 동안 300 x g에서 centrifuged 있습니다. supernatants 제거와 산탄들이 resuspended 있습니다. resuspended 알약은 Iscove의 수정 Dulbecco의 중간 [IMDM (Gibco)] 1 ML의 총 부피에서 한 튜브에 결합 10% AB inactivated + 열 (30 분 56도 ° C) 인간 혈청 (HS)와 보충과 함께 집계 hemacytometer. 세포 현탁액의 볼륨이 NK 세포의 최종 농도가 3×10 6 / ML되도록 IMDM w/10 %의 HS로 조정됩니다. 세포 현탁액는 반으로 쪼개 수 있습니다. NK 세포의 한 세트는 재조합 인간 인터루킨 – 2 200 U / ML을 받게됩니다. 세포의 다른 집합은 시토킨 치료하지 않고 중간에 남아 있습니다. NK 세포 문화는 다음 37 ° C, 5 % CO 2에서 하룻밤 incubated 아르 그 결과 NK 세포는 다음 CD107a의 degranulation 분석 또는 51 피크 자료 분석 중 하나에 대한 효과기 세포로 사용됩니다. 4. HIV – 1 감염된 세포의 정화 (그림 1 참조) 감염된 세포를 포함하는 문화 유체는 접시에서 제거 및 브레이크와 함께 10 분 동안 300 x g에서 centrifuged 있습니다. 뜨는은 aspirated되고 알약은 hemocytometer에서 집계 2퍼센트 FBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 세포와 PBS 2 ML에 resuspended 있습니다. HIV – 1을 포함하지 않는 감염된 세포는 HIV – 1은 아래 CD4을 modulates 사실을 활용하여 바이러스를 항구 사람으로부터 멀리 격리됩니다. 이러한 목적의 CD4 양성 반응이 절연 키트 (Invitrogen은) 1 – CD4 세포의 비율마다 구슬이 사용되는 예외와 함께 제조 업체의 지침에 따라 사용됩니다. CD4 + T – 세포의 제거되면, 죽은 세포는 제조 업체의 지침에 따라 죽은 세포 제거 키트 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 바이러스를 품고 정화 세포 인구에서 제거됩니다. 흐름을 통해 열에서 죽은 세포 제거를 따라가에 브레이크와 함께 10 분 동안 300 x g에서 centrifuged입니다. 뜨는 제거, 산탄 1 ML RPMI 완성에 resuspended와 세포가 계산됩니다. 정화 감염된 세포는 지금 CD107a의 degranulation 분석 또는 51 피크 자료 분석의 대상으로 사용을위한 준비가되어 있습니다. 5. CD107a의 Degranulation 분석 (그림 2 참조) NK 세포 문화는 접시에서 제거하고 세포 현탁액이 계산됩니다. NK 세포 suspensions이에 브레이크와 함께 10 분 동안 300 x g에서 centrifuged 있습니다. NK 세포는 RPMI 완성에 resuspended와 최종 농도가 10 6 세포 / ML로 조정됩니다. 위의 단계에서 생성된 고립 감염과 감염되지 않은 T – 세포에서 세포 suspensions이에 브레이크와 함께 10 분 동안 300 x g에서 centrifuged 있습니다. Supernatants가 제거되고 산탄들이 2×10 6 셀 / ML에서 RPMI 완성에 resuspended. K562 세포들은 북한 용해에 매우 민감한로 긍정적인 제어 대상 세포로 사용됩니다. 티그는 세포에서 브레이크와 함께 10 분 동안 300 x g에서 centrifuged 있으며, supernatants가 2×10 6 셀 / ML에서 RPMI 완성에 제거하고 산탄들이 resuspended 아르 에서는 96 V – 바닥 잘 판 100 대상 100 mcL의 effectors의 m​​cL가 우물에 추가됩니다. 물론 타겟 세포없이 100 mcLof의 effectors와 매체의 100 mcL를 포함한가 아닌 특정 NK 세포 degranulation에 사용됩니다. 각 물론 10 mcLFITC – 복합 백신 CD107a (BDIS)에 추가됩니다. 접시 그런 다음에 브레이크 2 분 20 X g에서 centrifuged입니다. centrifuged 판은 37 ° C와 5% CO 2에서 4 시간 동안 incubated입니다. 부화 후 접시가에 브레이크를 5 분 동안 400 X g에서 centrifuged입니다. 뜨는은 펠렛에서 제거됩니다. 각 물론 그 다음 100 mcLof 흐름 버퍼 (PBS w / 2% FBS와 0.1 % 넝 3)의 총 20 분 동안 얼음 fluorochrome – 복합 항체의 다음 패널 물들일 수 있습니다 anti-CD3/14/20 [퍼시픽 블루 복합 (Biolegend)] 안티 CD56 [APC (Biolegend)] 20 분 부화 후, 흐름 버퍼 200 mcL은 각 잘 추가하고 접시가에 브레이크를 5 분 동안 400 X g에서 centrifuged입니다. 흐름 버퍼는 다음 조심스럽게 각 잘 펠렛을 방해하지 않도록하는 동안 200 mcL의 micropipet 팁 장착되어 2 ML aspirating pipet을 사용 aspirated입니다. 15 단계와 16은 한번 더 반복합니다. 우박은 CMF PBS에 1 % paraformaldehyde 200 mcL에 resuspended 있습니다. 셀 suspensions 그러면 유동 튜브로 전송됩니다. 총 부피는 각 튜브에 CMF PBS에 1 % paraformaldehyde의 ~ 100 mcL을 추가하여 300 mcL까지 가지고있다. NK 세포에 해당하는 이벤트 (2×10 4) 외과 디바 (BDIS) 취득을위한 소프트웨어 및 흐름 조 소프트웨어 (TreeStar)를 사용하여 분석을 사용하여 흐름 cytometer에 의해 저장됩니다. 6. CD107a의 게이팅 전략 (그림 3 참조) 단세포 게이츠는 앞으로 흩어 높이 (FSC – H) VS 앞으로 스캐터 폭 (FSC – W) 계획을 사용하여 만들어집니다. 크기는 대 단위 계획에 대한 FSC 대 사이드 분산형 (SSC) 플롯은 단일 세포 게이트에 만들어집니다. 일반적으로 lymphocytes는 비교적 낮은 입도와 중간 세포 크기를합니다. monocytes (CD14), T – 세포 (인 경우에는 3 번 CD)와 B – 세포 (생략 동안 림프구 게이트의 세포는 다음 NK 세포에 CD3/14/20 스테인드 세포 대 게이트 CD56 스테인드 세포의 도트 음모에 역모 아르 CD20). CD56 POS 문이 인구는 다음 CD107a에 대한 평가입니다. 대상 그룹없이 NK 세포는 CD107a가 부정적인 것으로 간주 무엇을위한 게이트를 설정하는 데 사용됩니다. 7. 51 피크 릴리스 분석 (그림 4 참조) 감염 대상 세포가 37 500 mcL 총 2 시간에 대한 saline/10 6 셀 125 mcCi 51 피크 (퍼어킨 엘머)로 표시 아르 ° C와 5% CO 2. 긍정적인 제어로 10 6 K562 세포가 37 500 mcL 총 2 시간 100 mcCi 51 피크로 표시 아르 ° C와 5% CO 2. 전체 볼륨이 RPMI 완성 500 mcL까지 가지고있다. 피크가 대상 세포에 추가된 51 볼륨 여기서 계산됩니다 : (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator) 대상 세포 라벨 있지만, 이전에 분리된 NK 세포는 문화에서 제거하고 계산됩니다. NK 세포를 포함하는 셀 문화가에 브레이크와 함께 10 분 동안 300 x g에서 centrifuged 있습니다. NK 세포를 포함하는 동반한는 RPMI 완성에 resuspended 3 튜브로 분할됩니다. 세포 밀도는 하나 튜브, 두 번째 튜브에서 2.5×10 5 / ML와 세 번째 튜브에서 5×10 5 / ML 10 5 / ML로 조정됩니다. 표시 목표 셀은 인큐베이터에서 제거되며 RPMI 완성 4.5 ML 각 튜브에 추가됩니다. 튜브 그러면 300 x GF 또는 10 분 centrifuged 있습니다. 뜨는 신중 같은 방사성 액체 폐기물에 대한 컨테이​​너로 펠렛을 방해하지 않도록 해제 부어있다. 4 단계와 5 단계는 모든 unabsorbed 51 피크를 제거하는 두 번 더 반복하고 있습니다. 세 번째 세척에서 Supernatants가 아닌 액체 방사성 폐기물을 용기에 폐기 수 있습니다. 표시 대상은 다음 10 5 / ML의 최종 세포 농도에 RPMI 완성에 resuspended 있습니다. 표시 대상 100 mcL은 / 잘 10 4 대상 세포의 최종 핸드폰 번호에 대한 96 V – 하단에 잘 접시의 우물에 aliquoted 있습니다. Table1은 51 피크 자료 분석을위한 전형적인 설정의 예입니다. 각 그룹은 세중의에서 수행됩니다. 1 2 <tD> 3 4 5 6 7 8 9 K562 E : T (1:1) K562 E : T (1:1) K562 E : T (1:1) K562 E : T (2.5:1) K562 E : T (2.5:1) K562 E : T (2.5:1) K562 E : T (5시 1분) K562 E : T (5시 1분) K562 E : T (5시 1분) B UI E : T (1:1) UI E : T (1:1) UI E : T (1:1) UI E : T (2.5:1) UI E : T (2.5:1) UI E : T (2.5:1) UI E : T (5시 1분) UI E : T (5시 1분) UI E : T (5시 1분) C HIV – 1 감염된 E : T (1:1) HIV – 1 감염된 E : T (1:1) HIV – 1 감염된 E : T (1:1) HIV – 1 감염된 E : T (2.5:1) HIV – 1 감염된 E : T (2.5:1) HIV – 1 감염된 E : T (2.5:1) HIV – 1 감염된 E : T (1:1) HIV – 1 감염된 E : T (1:1) HIV – 1 감염된 E : T (1:1) D E F K562 자연 출시 K562 자연 출시 K562 자연 출시 UI 자연 출시 UI 자연 출시 UI 자연 출시 HIV – 1 감염된 자연 출시 HIV – 1 감염된 자연 출시 HIV – 1 감염된 자연 출시 G K562 최대 출시 K562 최대 출시 K562 최대 출시 UI 최대 릴리스 UI 최대 릴리스 UI 최대 릴리스 HIV – 1 감염된 Maxmum 릴리스 HIV – 1 감염된 Maxmum 릴리스 HIV – 1 감염된 Maxmum 릴리스 위의 NK 세포 suspensions 100 mcL은 각 잘 포함하는 대상 세포에 추가됩니다. 목표 100 mcL는 효과기 세포가 최대과 자연 릴리즈 그룹 결석되는 해당 우물에 추가됩니다. 자연 릴리스 그룹 RPMI 완성의 추가 100 mcL와 incubated입니다. 96 – 웰 플레이트가에 제동 2 분 20 X g에서 centrifuged입니다. centrifuged 접시는 다음 37 incubated 수 있습니다 ° C, 5 % 4 시간 CO 2. RPMI 완성 인간의 적혈구의 1시 10분 희석의 4 시간 배양 5 mcL 후 최대 릴리스 우물을 제외한 각 잘에 추가됩니다. 10 % 나트륨 dodecyl 황산 100 mcL는 최대 릴리스 우물에 추가됩니다. 접시는 펠릿 세포 5 분 400 X g에서 centrifuged입니다. 셀 – 무료 뜨는 100 mcL은 각 우물에서 수확하고 별도의 감마 카운터 튜브 (퍼어킨 엘머)에 배치됩니다. 튜브는 2470 자동 감마 카운터 (퍼어킨 엘머)에 배치됩니다. 문화 유체에 51 피크 선물의 금액은 2 분 독서의 평균에서 분당 카운트로 측정됩니다. 샘플 컨트롤의 분당 카운트 (CPM) 수치는 다음 방정식을 사용하여 특정 용해 %를 계산하는 데 사용됩니다 : [(실험 CPM – 자발적인 CPM의 의미) / (최대 CPM의 의미 – 자연 노출당 비용 (CPM)을 의미)] X 100 8. 대표 결과 : 그림 1. 자연 킬러 세포의 분리에 관련된 단계과 세대 HIV – 1 주변 혈액에서 감염 대상 세포. 그림 2. effectors와 K562 세포, CD4 + 감염되지 않은 T – 세포 및 대상과 같은 T – 세포가 HIV – 1 감염으로 NK 세포를 이용한 CD107a의 degranulation 분석의 건설에 참여 단계를 반복합니다. 그림 3. CD107a의 degranulation 분석에 대해 흐름 cytometry – 게이팅 전략.의 줄거리에 대한 단일 세포 제외 대단히 짧은 시간 또는 doublets에 (A) 게이팅 FSC – A (전진 분산형 지역) VS FSC – H (전진 분산형 높이). (B) 단일 세포 게이트는 림프구 인구에 FSC – A VS SSC (사이드 분산형) 게이팅로 꾸몄다. (C) 림프구의 게이트 CD3/14/20로 꾸몄다(T – 세포, monocytes, B – 세포) VS CD56 (NK 세포) CD56 POS andCD3/14/20 neg 인구 (NK 게이트)에 게이팅. (D) NK 게이트 (CD107a POS) degranulated이 NK 세포를 시각화하는 CD107a VS CD56로 꾸몄다. 그림 4. effectors와 K562 세포, CD4 + 감염되지 않은 T – 세포 및 대상과 같은 T – 세포가 HIV – 1 감염으로 NK 세포를 이용한 51 피크 자료 분석의 건설에 참여 단계를 반복합니다. 그림 5. 대한 자연 살인자의 세포 독성 반응을 평가하기위한 대표적인 결과 HIV – 1 감염 세포. (A) NK 세포가 목표없이 K562 세포에 대한 응답으로 degranulate 자신의 능력에 대한 평가했다, 기본 CD4 + T – 세포와 HIV 감염 기본 T – 세포 으로 표현 표면 CD107a NK 세포의 비율에 의해 평가. 각 사분면에있는 숫자는 총 NK 세포의 비율을 나타냅니다. T) : B) NK 세포는 세포 비율 (E를 대상으로 다양한 효과기 세포에서 51 피크 자료 분석에서 K562 세포, 감염되지 않은 CD4 + T 세포 및 T – 세포 HIV – 1 감염을 lyse 자신의 능력에 대한 평가입니다.