Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe
Summary
Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit kann verwendet werden, um zu analysieren und zu quantifizieren 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb einer spe cific locus werden. Das Kit unterscheidet 5-mC von 5-HMC von der Zugabe von Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-HMC über eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von β-glucosyltransferase (T4-BGT). Als 5-HMC im Rahmen der CCGG auftritt, wandelt diese Modifikation eines spaltbaren MspI Ort zu einer nicht-spaltbare Website.
Abstract
DNA Hydroxymethylierung ist eine lange bekannte Modifizierung von DNA, aber seit kurzem ein Schwerpunkt in der epigenetischen Forschung. Mammalian DNA wird enzymatisch an der 5 th Kohlenstoff-Position von Cytosin (C)-Reste bis 5-mC geändert, überwiegend im Zusammenhang mit der CpG-Dinukleotide. 5-mC zugänglich ist enzymatische Oxidation zu 5-HMC von der Tet-Familie von Enzymen, die vermutlich in Entwicklung und Krankheit beteiligt sind. Derzeit ist die biologische Rolle von 5-HMC nicht vollständig verstanden, sondern ist auf großes Interesse, da ihr Potential als Biomarker. Dies ist auf mehrere bahnbrechende Studien zu identifizieren 5-Hydroxymethylcytosin in embryonalen Maus-Stammzellen (ES) und neuronalen Zellen.
Forschung Techniken, einschließlich Bisulfit-Sequenzierung Methoden sind nicht in der Lage, problemlos zwischen 5-mC-und 5-hmc unterscheiden. Ein paar Protokolle existieren, die Gesamtbeträge von 5-Hydroxymethylcytosin in das Genom zu messen, einschließlich Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Analyse oder Dünnschichtchromatographie einzelner Nucleoside aus genomischer DNA verdaut gekoppelt. Antikörper, die auf 5-Hydroxymethylcytosin gibt es auch, die für Dot-Blot-Analyse, Immunfluoreszenz oder Fällung von hydroxymethylierten DNA verwendet werden, können aber diese Antikörper nicht haben Einzel-Basis resolution.In Darüber hinaus hängt die Auflösung auf die Größe des immunpräzipitiert DNA und für Microarray-Experimenten, hängt davon ab, Sonde Design. Da nicht bekannt ist, wo genau 5-Hydroxymethylcytosin in das Genom oder seine Rolle in der epigenetischen Regulation existiert, sind neue Techniken erforderlich, die spezifischen Locus Hydroxymethylierung identifizieren. Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit bietet eine Lösung für die Unterscheidung zwischen diesen beiden Änderungen an bestimmten Orten.
Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit ist eine einfache und robuste Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von 5-Methyl-und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb eines bestimmten DNA-Locus. Diese enzymatische Ansatz nutzt die Differential-Methylierung Empfindlichkeit des Isoschizomere MspI und HpaII in einer einfachen 3-Schritt-Protokoll.
Genomic DNA von Interesse ist mit T4-BGT behandelt, indem eine Glukose moeity bis 5-Hydroxymethylcytosin. Diese Reaktion ist Sequenz-unabhängige, also alle 5-HMC glucosylierten werden; unmodifizierte oder 5-mC mit DNA wird dadurch nicht beeinflusst.
Diese Glucosylierung wird dann durch Restriktionsendonukleaseverdau gefolgt. MspI und HpaII erkennen die gleiche Sequenz (CCGG), sind aber empfindlich auf unterschiedliche Methylierung Staaten. HpaII spaltet nur einen komplett unveränderten Ort: jede Änderung (5-mC, 5-HMC-oder 5-ghmC) an beiden Cytosin-Blöcke Spaltung. MspI erkennt und schneidet 5-mC-und 5-HMC, aber nicht 5-ghmC.
Der dritte Teil des Protokolls ist eine Abfrage der Locus durch PCR. So wenig wie 20 ng der DNA-Eingang genutzt werden kann. Verstärkung der experimentellen (glucosylierten und verdaut) und Kontrolle (mock glucosylierten und verdaut) Ziel-DNA mit Primer flankieren CCGG Ort von Interesse (100-200 bp) durchgeführt wird. Wenn der CpG site enthält 5-Hydroxymethylcytosin, ist eine Band nach Glucosylierung und Verdauung erkannt, aber nicht in den nicht-glucosylierten Kontroll-Reaktion. Real-time PCR gibt eine Annäherung, wie viel Hydroxymethylcytosin ist in diesem besonderen Ort.
In diesem Experiment werden wir die 5-Hydroxymethylcytosin Betrag in eine Maus Babl / C Gehirn Probe zu analysieren, indem Endpunkt PCR.
Protocol
Discussion
Es gibt einige kritische Dinge zu beachten bei der Einrichtung dieses Experiment. Zunächst ist es wichtig, dass die Glucosylierung der genomischen DNA vollständig verläuft. Die Sequenz-Spezifität der T4-BGT ist nicht bekannt, und es scheint keine andere Wahl für das Substrat Folge haben. Daher ist in einigen Fällen kann längere Inkubationszeiten notwendig sein. Zweitens MspI und HpaII Verdauung muss, um Hintergrund-Signal zu vermeiden abzuschließen. Für diese Restriktionsenzyme, empfehlen wir eine Inkubationszeit von 4 Stunden, aber mehr Inkubationen können durchgeführt werden, wenn unvollständige Spaltung beobachtet werden. Drittens kann Input DNA-Menge angepasst je nach Verfügbarkeit, seit 20 ngs der DNA für die Endpunkt-PCR verwendet werden kann. Schließlich empfehlen wir die Nutzung der mitgelieferten Kontroll-DNA, die parallel mit genomischer DNA für 5-mC und 5-HMC Quantifizierung kann ausgeführt werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Gyeong Chin, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, Steven E. Jacobsen s Labor, UCLA. Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH 1R44GM095209-01 unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit | New England Biolabs | E3317 | ||
| Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest | Custom per experiment; provided by user | |||
| LongAmp® Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0323 | ||
| dNTPs | New England Biolabs | N0447 | ||
| molecular biology grade water |
References
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