Electrofisiología del Escorpión Peg sensilla

1. Pre-registro, preparación de animales vivos Quitar el escorpión de su frasco en casa y colocarlo en un recipiente de vidrio pre-enfriado, al lado, coloque el frasco que contiene el escorpión en un entorno de congelación (-5 ° C) durante un mínimo de dos minutos. Este tiempo puede variar de acuerdo a la edad, tamaño, especie, etc de los específicos de escorpión en estudio. Pero, en general, la fase de congelación medio ambiente se completa una vez que el animal no se mueve. Después de dos minutos, retire el inmovilizado escorpión del envase de vidrio en frío y luego colocar la parte ventral hacia arriba en un portaobjetos de microscopio. Asegurar el aguijón, cola, piernas y pedipalpos con la arcilla moldeable (a base de aceite, Van Aken Plastalina). Hacer una plataforma en la que poner pectinas del escorpión. Ajustar la longitud de la plataforma y el ancho de acuerdo al tamaño de los géneros Pecten. Por lo general, nuestras plataformas están construidas con microscopio de vidrio cubierta y son aproximadamente 10 (L) x 18 (W) mm. Se adhieren a doble cara cinta adhesiva a la plataforma de Pecten, el recorte de la cinta (si es necesario) para que quepa. Para hacer que una cámara de pectinal, poner tres de los cuatro lados de la plataforma en la pre-fundido de cera (nosotros usamos la cera de abejas 100% de los chips) a una profundidad de 3-4 mm. Nos derretir la cera mediante la colocación de los chips en una placa de Petri de vidrio, que se encuentra en un plato caliente. Una vez que la cera en los bordes de la cámara de pectinal se enfría a temperatura ambiente, debe crear las paredes de cera alrededor de 1 mm de alto. En el animal, localizar el punto de inserción pectinal, y coloque el borde sin encerar de la plataforma (la cinta de lado hacia arriba) justo por detrás de él. Después, estabilizar la plataforma (para que no se mueva más adelante) presionando suavemente su derecha e izquierda bordes periféricos en contra de la arcilla utilizada para restringir las patas del animal. Use unas pinzas de punta fina para colocar con cuidado el Pecten o pectinas dentro de la cámara. En concreto, el uso de fórceps, mantenga el Pecten a lo largo de la columna vertebral pectinal, y pase suavemente el Pecten de debajo de la cubierta de vidrio y lo baja en el suelo de la plataforma adhesiva. Establecer un vínculo pecten-a-cinta con cuidado la aplicación de presión a la columna vertebral pectinal. Ahora aplique la cera derretida (se utiliza una espátula de metal previamente calentado) hasta el borde sin encerar de la plataforma. El objetivo es doble, para asegurar el Pecten y para encerrar totalmente la cámara para la futura introducción de aceite mineral. Tenga cuidado al aplicar la cera sobre Pecten del animal, ya que es posible dañar el Pecten con la cera que está demasiado caliente. La construcción de la cámara de Pecten se ha completado. A continuación, establecer una conexión con el electrodo indiferente hemolinfa de los animales mediante la inserción de un alambre de plata entre dos segmentos de la cola. 2. Grabación simultánea extracelular y estimulación química Nosotros preparamos los animales 24 horas antes de realizar extracelular, punta de las grabaciones, que, entre otras razones (es decir, el ajuste de los animales de posición fija), da tiempo a medida que las pipetas de un estimulante específico (sensillum-dependiente) la punta de diámetro. Nosotros usamos un extractor de micropipeta para el logro de dichas especificaciones. Idealmente, el diámetro de las pipetas es ≈ 2 m mayor que el diámetro de los poros sensillas. Nos ajustamos nuestras especificaciones micropipeta en consecuencia, para cada animal. 1 h antes de la grabación, se añade 5 l de aceite mineral a la cámara de pectinal, sumergiendo el Pecten en aceite. Entonces, la posición del animal debajo de un microscopio de alta potencia, que durante mucho tiempo de trabajo los objetivos de la distancia y el epi-iluminación. Para estimular la vinculación química sensilla, se introducen sustancias sápidas acuosa (es decir, ácido cítrico y sal) a través del medio de aceite. En primer lugar, se utiliza una micropipeta de relleno para inyectar el estimulante dentro de la pipeta estimulante. Nota: todas las soluciones estimulantes deben contener un electrolito de la conductancia eléctrica. A continuación, después de colocar la pipeta estimulante en un micromanipulador (en el equipo de grabación), insertar el electrodo de registro en el extremo romo, abierto de la pipeta estimulante. Es importante asegurar el contacto entre el electrodo de metal y una solución electrolítica estimulante. Una vez que la preparación es una toma de tierra (a través del electrodo indiferente), sólo inferior de la pipeta a través del medio del petróleo y en un poro sensillas. La duración de la estimulación química por sensillum pectinal puede variar de tanto como treinta minutos a tan sólo un segundo. Por lo general, se pueden degustar las clavijas múltiples (> 30) por la pipeta. En el caso de que la pipeta estimulante se tapa con escombros minutos, simplemente el intercambio de la pipeta obstruida por una pipeta nueva, sin uso. 3. La preparación de un animal durante varios días de experimentación Si el animal se va a utilizar durante un período de tiempo prolongado, se recomienda volver a utilizar la cámara pectinal y sustitución de la gota de aceite mineral para cada sesión de grabación. Después de la sesión de un día determinado de la grabación, retire el animal de la grabación de puesta a punto y realizar un lavado de aceite mineral. Especificacionesficamente, añadir una gota (5 l) de aceite mineral a la cámara, y retirar todo el aceite. Esto ayuda a minimizar la presencia del estimulante residual, que puede haberse escapado hacia fuera de la pipeta durante la sesión de grabación. Antes de la sesión siguiente, agregue una gota de aceite como se describió anteriormente. 4. Los resultados representativos: Dependiendo del aparato de control utilizado (por ejemplo, el amplificador en particular, la digitalización de hardware, etc), un resultado representativo es un registro extracelular con una S: N de al menos 3:1. Construcción exitosa de la cámara de aceite mineral es necesario para aislar a la estimulación química sensilla individual, ya que proporciona un medio para la entrega de químicos estimulantes del gusto polar (a base de agua) 8. Si hay muy poco aceite o ninguno en absoluto, la solución estimulante se extenderá desde el sensillum registrado a su sensilla vecinos, lo que es probable que cause una enfermedad prolongada y sin control de la estimulación química 8.