Kompozit Bitkiler Üretimi Medicago truncatula Nodül Tahliller için kullanılan

Aşağıdaki protokol, bir model baklagil türleri M. kıllı kompozit bitkilerin kök oluşturmak için kullanılan truncatula. Benzer protokolleri en az sekiz 1-4 bitki türleri için adapte edilmiştir. M. kullanılan truncatula kıllı kök kompozit bitkilerin kök ve nodül gelişimi gen fonksiyonları çalışma. 2) kıllı kök kompozit üretim tesisleri; 3) simbiyotik Rhizobia enfeksiyonu ve 4) transgenik kök kimlik bitki materyali hazırlama) 1: protokol dört bölüme ayrılmıştır. Biz transgenik kompozit bitkilerin kök 3 tarama için bir muhabir olarak, yeşil flüoresan protein (GFP) geni içeren ikili bir vektör kullandı. Antibiyotik-temelli seçimi ile karşılaştırıldığında, GFP tabanlı tarama, hızlı, kolay ve ucuzdur. Bizim inşa ER-ifade-optimize GFP geninin transgenik ve transgenik olmayan kökleri arasında kolay ayrım sağlayan, transgenik kökleri güçlü kurucu GFP sinyalleri süper ubikuitin organizatörü tarafından tahrik edilir. 1. Bitki Materyali Hazırlama M. truncautla tohumları serada yetiştirilen bitkiler (% 50 bağıl nem, 16 / 8 saat ışık / karanlık, 22/18 ° C gün / gece sıcaklık) hasat edilir. Olgun tohumları 4 ° C'de saklanabilir Yaklaşık 100 tohumları periyodik sallayarak 10 dakika için 10 ml konsantre sülfürik asit (% 95-98, Sigma-Aldrich, MO) Kırma. Tohumlar 5-7 kez yavaşça sallanarak steril su ile durulanır. Bu tohumlar daha sonra 6 saat boyunca oda sıcaklığında suya batırılmış ve 4 ° C 36-48 saat çimlenme senkronize etmek için tutulur. Yaklaşık 20-30 tohum, bir Petri kabındaki yerleştirilen nemli filtre kağıtları üzerinde yayılır. 22 korunur ° C, 16 / 8 saat aydınlık / karanlık döngüsünü ve 40 ile μmol.m -2 s -1 ışık yoğunluğu, 5-6 gün boyunca. Çimlenmiş fideler toprağa aktarılır ve bir ay boyunca sera yerleştirilir. 2. Tüylü Kök Kompozit Tesisleri oluşturuluyor İkili yapıları ilgi genleri taşıyan A. dönüştü standart protokolleri kullanarak rhizogenes. Biz transgenik dokuların tarama kolaylaştıracak bir belirteç olarak GFP genini içeren bir dizi ikili vektörler tasarladık. Bu bağlamda, çeşitli rehberleri içeren ve tüm Gateway aşırı ifadesi veya hedef genlerin 3,5, susturma klonlama siteleri (Invitrogen, Carlsbad, CA). A. rhizogenes uygun antibiyotik seçimi ile 28 50ml LB orta ° C de 16-24 saat kültür. Bakteriler azot bitki besin solüsyonu (Tablo 1 ve 6) = 0.3 toplanan ve OD 600, nihai konsantrasyonu yeniden askıya alınır. Kıllı kök rejenerasyon, steril bir matriks (Taşyünü ", Hummert Uluslararası, Earth City, MO) desteklemek için yaklaşık 3 cm 3 fişler halinde kesilir. Biz 4 fişler bir Petri kabı içine yerleştirin. Eksplantlar ekleme kolaylaştırmak için bir pipet kullanarak her fiş üstüne bir delik dürttü. A. rhizogenes (5 ml) her fiş eklenir. 2-3 aksiller tomurcukları ile bir çekim bölümünde çekik bir kesim tarafından eksize edilir. Eksplant sonra fişi içine eklenir ve 22 ° C'de yaklaşık üç hafta boyunca yetiştirilen. Biz 5 ml azot içermeyen bir çözüm gerektiğinde su onları, daha sonra, ilk 10 gün boyunca sulama olmadan Medicago eksplantlar tutmak . Biz apikal meristem çıkarmadan adventif köklerin oluşumunu düşürebilir bulundu. 3. Simbiyotik Rhizobia (Sinorhizobium meliloti) Enfeksiyon Üç hafta sonra, bazı adventif kökler Taşyünü ortaya çıkacaktır. Kıllı kök kompozit bitkiler Taşyünü ile veya olmadan, kum veya vermikülit (steril) aktarılır. Bu serada yetiştirilen 22 ° C, 16 / 8 saat aydınlık / karanlık döngüsü, ve 300 μmol.m -2 -1 ışık yoğunluğu bir hafta daha. Rhizobia enfeksiyonu, S. önce meliloti 1201, 50 ml maya özü-mannitol 30 ° C (Tablo 2 ve 6,7) 7 gün boyunca orta kültüre . Yeniden askıya rhizobia hücreleri OD 600 nihai konsantrasyonu = 0.08 kullanarak azot ücretsiz beslenme çözüm seyreltilir. S. 10 ml taze süspansiyon meliloti nodül oluşumu ikna etmek için her kompozit tesisi yapıldı. 4. Transgenik Kök Tanımlama Rhizobia aşılama İki hafta sonra, bileşik bitkiler su ile yıkama kadar köklü. Kökleri, suda kolayca kum veya perlit ayrılabilir. Biz bir UV-mikroskop altında (Nikon SMZ1500 Uyartım 460-500nm, Dikroik 505nm, 510nm daha Bariyer) kıllı kökleri yer. Transgenik kökleri GFP pozitif ve adventif kökler GFP negatif. Daha sonra kökleri accordin toplamakg GFP sinyal ve nodül numaraları sayısı, kök uzunluğu ölçmek ve yan kök yoğunluğunu hesaplamak. GFP negatif kökleri kontrol olarak kullanılır. 5. Temsilcisi Sonucu Yaptığımız denemelerde, yeni saç köklerinin A. eksplantlar sonra 2-3 hafta içinde yeniden rhizogenes aşılar. UV-mikroskop altında, GFP geni taşıyan transgenik kökleri güçlü yeşil floresan (Şekil 1). Rejenere kökleri ve GFP pozitif kökleri kısmını miktarı eksplantlar ve bileşik plants.On ortalama büyüme ortamı şartlarına bağlıdır, üretilen köklerinin% 25, transgenik kıllı kökleri 3. Dönüşüm verimliliği, 1) artırmak için videoda gösterildiği gibi plastik kapak azap, ilk birkaç gün boyunca büyüme tepsiye nemi korumak için yeterli olup, bitkilerin sadece ilk birkaç gün içinde çok az suya ihtiyaç duyarlar. Aşırı sulama kıllı kök oluşumu için zararlıdır; 2) Agrobacterium innoculant konsantrasyonu dönüşüm için önemlidir. Aşırı miktarda hücre kıllı kök oluşumu veya nodül oluşumu için yararlı değildir. Nodül oluşumu için, sulama çözüm azot serbest olması gerekir, aksi takdirde birkaç nodüller oluşturacak. Kıllı kök kompozit bitkilerin başlangıç ​​materyali olarak kotiledonlarında veya entact fide kullanarak oluşturulabilir. Yukarıdaki protokol sadece küçük değişiklikler diğer dokular 8 kıllı kökleri oluşturmak için ncessary. Önemli olan, her kıllı kök bağımsız bir dönüşüm olayı. Bu nedenle, tek bir kompozit bitki gözlenen fenotipleri birden fazla kompozit tesislerinde tekrarlar tarafından teyit edilmesi için gereken birkaç transforamtion olayların toplamıdır Şekil 1. A. Transgenik kökleri kıllı kökleri dışarı sıralanabilir. B. Nodüller kıllı kök kompozit tesislerinde kuruldu. 4 haftalık M. yerleştirilir UV-mikroskop ve GFP pozitif kökleri altında truncatula kıllı kök bitkiler kolayca tespit edilebilir. (Kırmızı ok: GFP kök; Sarı ok: non-GFP kök) Hisse senedi g/200ml ml stok / litre MgSO 4 .7 H 2 O 12,3 2 CaCl 2 .2 H 2 O 14,7 4 K 2 HPO 4 .3 H 2 O 6,8 1 K 2 SO 4 11 4 Fe Cl 3 .6 H 2 O 0,49 2,5 Mikrobesinler Aşağıya bakın 1 Mikrobesinler g litre başına H 3 BO 3 0,142 MnSO 4 H 2 O 0,077 ZnSO 4 .7 H 2 O 0,1725 CuSO 4 .5 H 2 O 0,037 NaMoO 4. H 2 O 0,024 CoCl 2. H 2 O 0,0025 Niso 4 0,001 (Tablo 1). Nitogen içermeyen bir beslenme çözümü K 2 HPO4 0.5g NaCl 0.1g MgSO 4 · 7H 2 O 0.2g Maya Ekstraktı 0.4g Mannitol 10g pH = 6.8 Tablo 2. maya (litre) mannitol orta ayıklamak