Geração de plantas em Composite Medicago truncatula Utilizado para Ensaios Nodulação

O protocolo a seguir foi usado para gerar plantas raiz peludo composto em um modelo de espécies de leguminosas M. truncatula. Protocolos semelhantes foram adaptados para pelo menos oito espécies de plantas 1-4. Usamos M. plantas raiz truncatula peludo composto para estudar as funções dos genes no desenvolvimento de raiz e de nódulos. O protocolo foi dividido em quatro seções: 1) materiais vegetais a preparar, 2) geração de plantas de raiz peludo composto; 3) infecção rizóbios simbiótica e 4) transgênico identificação raiz. Utilizou-se o vetor binário contendo o gene da proteína verde fluorescente (GFP) como repórter para a triagem da raiz nas plantas transgênicas composto 3. Em comparação com antibióticos baseado seleção, GFP-despistagem é rápido, fácil e barato. Em nossa construção, a ER-expressão otimizado gene GFP é conduzido pelo promotor de super ubiquitina, que tem fortes sinais GFP constitutiva em raízes transgênicas, permitindo fácil distinção entre raízes transgênicas e não transgênicas. 1. Preparação de materiais vegetais Sementes de M. truncautla são colhidos a partir de plantas cultivadas em uma estufa (50% de umidade relativa, 16 / 8 h claro / escuro, 22/18 ° C de temperatura dia / noite). Sementes maduras podem ser armazenados a 4 ° C. Cerca de 100 sementes são escarificadas em 10 ml de ácido sulfúrico concentrado (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) por 10 min com agitação periódica. As sementes são lavadas 5-7 vezes com água esterilizada com agitação suave. As sementes são, então, embebidos em água à temperatura ambiente por 6 horas e mantidos a 4 ° C por 36-48 horas para sincronizar a germinação. Cerca de 20-30 sementes são espalhadas em papel de filtro úmido colocado em uma placa de Petri. Eles são mantidos a 22 ° C, com 16 / 8 h ciclo claro / escuro, e 40 μmol.m -2. Intensidade da luz s -1, por 5-6 dias. Plântulas germinadas são transferidas para o solo e colocadas em estufa por um mês. 2. Geração de Plantas Root Cabeludo Composite Constrói binários portadores de genes de interesse foram transformados em A. rhizogenes utilizando protocolos padrão. Nós projetamos um conjunto de vetores binários contendo o gene GFP como um marcador que facilitam a triagem de tecidos transgênicos. Esses vetores contêm promotores diferentes e todos têm sites de Gateway de clonagem (Invitrogen, Carlsbad, CA) para a sobre-expressão ou silenciamento de genes alvo 3,5. A. rhizogenes é cultivada em 50ml de meio LB com a seleção antibiótico adequado a 28 ° C durante 16-24 horas. As bactérias são coletadas e re-suspenso para uma concentração final de OD 600 = 0,3 em uma solução nutritiva de nitrogênio livre de plantas (Tabela 1 e 6). Para apoiar a reabilitação de raiz peludo, uma matriz esterilizados de apoio ("Lã de Rocha", Hummert International, Earth City, MO) é cortado em plugs de aproximadamente 3 cm 3. Nós colocamos quatro velas em uma placa de Petri. Um buraco é picado por cima de cada vela usando uma ponteira de pipeta para facilitar a inserção de explantes. A. rhizogenes (5 mL) é adicionado para cada plugue. A seção de atirar com 2-3 gemas axilares é retirado por um corte oblíquo. O explante é então inserido no plugue, e cresceu a 22 ° C por cerca de três semanas. Mantemos os explantes Medicago sem molhar durante os primeiros 10 dias, então, molhá-los com 5 ml de solução de nitrogênio-livre, quando necessário. Descobrimos que a remoção do meristema apical pode diminuir a formação de raízes adventícias. 3. Simbiótica rizóbios (Sinorhizobium meliloti) Infecção Depois de três semanas, algumas raízes adventícias vão surgir a partir da lã de rocha. As plantas de raiz peludo compostos são transferidos para areia ou vermiculite (esterilizado), com ou sem a lã de rocha. Elas são cultivadas em estufa a 22 ° C, 16 / 8 h ciclo claro / escuro, e 300 μmol.m -2. S -1 de intensidade de luz para mais uma semana. Antes de rizóbio infecção, S. meliloti 1201 é cultivado em 50 extrato de levedura-manitol ml de meio por 7 dias a 30 ° C (Tabela 2 e 6,7). Células re-suspensão de rizóbio são diluídos para uma concentração final de OD 600 = 0,08 usando nitrogênio solução de nutrição gratuita. A suspensão de 10 ml fresca de S. meliloti foi aplicado para cada planta composto para induzir a formação de nódulos. 4. Identificação Root transgênicos Duas semanas após inoculação com rizóbio, as plantas são compostas de enraizadas pela lavagem em água. As raízes podem ser facilmente separadas das areias ou perlite na água. Nós colocamos as raízes cabeludas sob um microscópio UV (Nikon SMZ1500, Excitação 460-500nm, 505nm Dichroic, Barreira mais de 510 Nm.). As raízes transgênicas GFP são positivas e as raízes adventícias são GFP negativo. Em seguida, recolher as raízes according o sinal de GFP, e contar os números de nódulos, medir o comprimento da raiz, e calcular a densidade da raiz lateral. As raízes GFP negativos são usados ​​como controle. 5. Resultado representante Em nosso experimento, as raízes do cabelo novo reciclados a partir de explantes em 2-3 semanas após o A. rhizogenes inoculação. Sob o microscópio UV, raízes transgênicas com o gene GFP mostram forte fluorescência verde (Fig. 1). A quantidade de raízes regeneradas ea parte das raízes GFP positivos dependem das condições de explantes e do ambiente de crescimento da média plants.On composto, 25% das raízes foram produzidas raízes transgênicas 3. Para aumentar a eficiência de transformação, 1) a condenação tampa de plástico, como mostrado no vídeo, é suficiente para manter a umidade na bandeja de crescimento para os primeiros dias, e só as plantas necessitam de pouca água no primeiros dias. Rega excessiva é prejudicial para a formação de raízes cabeludas, 2) a concentração de inoculante Agrobacterium é importante para a transformação. Quantidade excessiva de células não são úteis para a formação de raízes cabeludas ou formação de nódulos. Para formação de nódulos, a solução de rega precisa ser isentos de azoto, caso contrário, nódulos poucos irá se formar. As plantas de raiz peludo composto pode ser gerado usando cotilédones ou mudas entact como o material de partida. Apenas pequenas modificações do protocolo acima são ncessary para gerar raízes cabeludas de outros tecidos 8. Importante, cada raiz peludo é um evento de transformação independente. Portanto, os fenótipos observados em uma planta composta são a soma de eventos transforamtion várias que precisava ser confirmado por repetições em várias plantas compostas Figura 1. A. raízes transgênicas pode ser resolvido a partir de raízes cabeludas. Nódulos B. foram formadas nas plantas raiz peludo composto. Colocamos quatro semanas de idade M. plantas raiz truncatula peludo sob o microscópio UV e as raízes GFP positivos podem ser facilmente identificados. (Seta vermelha: root GFP; seta amarela: não-GFP root) Estoque g/200ml ml de ações / litro MgSO 4 .7 H 2 O 12,3 2 CaCl 2 .2 H 2 O 14,7 4 K 2 HPO 4 .3 H 2 O 6,8 1 K 2 SO 4 11 4 Fe Cl 3 .6 H 2 O 0,49 2,5 Micronutrientes Veja abaixo 1 Micronutrientes g por litro H 3 BO 3 0,142 MnSO 4. H 2 O 0,077 ZnSO 4 .7 H 2 O 0,1725 CuSO 4 .5 H 2 O 0,037 NaMoO 4. H 2 O 0,024 CoCl 2. H 2 O 0,0025 Niso 4 0,001 Tabela 1. Solução de nutrição Nitogen livre K 2 HPO4 0.5g NaCl 0.1g MgSO 4 · 7H 2 O 0.2g Extrato de levedura 0,4 g Manitol 10g pH = 6,8 Tabela 2. Extrato de levedura manitol médio (por litro)