Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA

1. Colture cellulari di mammifero NU-ELISA può essere eseguita su qualsiasi tipo di cellula di mammifero che si può crescere in coltura. Noi preferiamo preparare da moderati a grandi lotti di cellule in modo che nucleosomi possono essere isolati in quantità sufficiente per preparare diversi piatti identico caricato ELISA, consentendo test con diversi anticorpi (Abs). Le scale cultura seguenti forniscono ampio materiale: Per il mouse cellule staminali embyronic, crescere uno o due 15 tavole cm di cellule senza cellule alimentatore. Per i fibroblasti, crescere 5-10 15 piatti cm a confluenza. 2. Isolamento dei nuclei Nota: Tutti i passi sono sul ghiaccio con pre-raffreddata buffer, ad eccezione di quanto indicato. Trypsinize celle con 3 tripsina ml per piastra, combinare e aggiungere 20 ml di ghiacciata PBS / butirrato. Centrifugare a 1000 rpm per 5 min. Risospendere le cellule in 10 ml di PBS / butirrato e centrifugare a 1000 rpm per 5 min. Risospendere in 4 ml di tampone di lisi con inibitori della proteasi (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce omogeneizzare 20 colpi di pestello di tipo B sul ghiaccio. Centrifugare a 2000g per 10 minuti a 4 ° C. (Il supernatante contiene citoplasma, che non è necessario per questo protocollo, ma può essere salvato per altri usi se lo si desidera). Risospendere il pellet in 2 ml di ghiaccio freddo lavare tampone C (con inibitori della proteasi). Strato di materiale risospeso in 5 ml cuscino di saccarosio 30%, poi centrifugare a 2400g per 5 minuti in un rotore oscillante. I nuclei migreranno attraverso cuscino, e detriti rimane a livello di interfaccia. Rimuovere tutti i volumi di liquido con attenzione e risospendere i nuclei in 250 microlitri di tampone di lavaggio ghiacciata C + inibitori della proteasi. 3. Isolamento dei nucleosomi da parte in situ Micrococcal nucleasi (MNase) digestione Noi utilizziamo una procedura in cui viene digerito cromatina in situ all'interno di nuclei da infondendo loro MNase, seguito da un trattamento ipotonico a guidare senza nucleosomi intatti nel sopranatante. Aggiungere 3 ml 0,1 M CaCl 2 al campione. Mettere in 37 blocchi ° C Calore. Permettono di assumere 37 ° C di temperatura. Aggiungere 2 unità MNase (Micrococcal nucleasi, Sigma-Aldrich, sciolto in 2 units/10μl nel buffer MNase), poi incubare a 37 ° C per 12 minuti, con frequenti rimontaggi con una punta di pipetta. Aggiungere 6 ml di 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0 per arrestare la reazione. Mettere in ghiaccio. Centrifugare a 2000g per 4 minuti, scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 300 ml 0,2 mm Na-EDTA. Conservare in ghiaccio per 1 ora con occasionali pipeting gentile. (Queste condizioni ipotoniche liberare nucleosomi privi di nuclei). Centrifugare a 3000 g per 4 minuti a 4 ° C. Salvare il surnatante, che contiene nucleosomi libero, sul ghiaccio. Risospendere il pellet di nuovo con 300 ml 0,2 mm Na-EDTA. Conservare in ghiaccio per 1 ora con occasionali pipeting gentile. Centrifugare a 3000g per 4 min a 4 ° C. Conservare il surnatante e si combinano con il sopranatante primo passo 5. I preparativi mononucleosome risultante può essere aliquotati e conservati a -80 ° C. Nota: la quantità di cromatina può essere crudamente quantificato misurando l'assorbanza a 260 nm di un campione di 10 microlitri aggiunto a 990 ml di acqua. A 260 = 10 (dopo aggiustamento per i 1 / 100 di diluizione) corrisponde a circa 1mg/ml della cromatina. Inoltre, durante la procedura di cui sopra, piccoli campioni possono essere conservati e successivamente analizzate per il loro contenuto di DNA per monitorare la qualità e l'estensione della digestioni MNase, che dovrebbe prevalentemente contengono DNA di 146 bp di lunghezza. Laddering è indicativo di digestione MNase incompleta. Nota: Fig.1 contiene una sintesi diagramma di isolamento nucleare e digestioni MNase passi. 4. Nucleosoma-ELISA (NU-ELISA) Rileviamo PTM sulle frazioni contenenti nativo nuclesosomes intatto che sono stati immobilizzati su 96 e piastre microtiter ELISA. Per ogni campione, facciamo una serie di 2-diluizioni, e questi sono rivestiti su pozzi in triplice copia. Cappotto piastre Maxisorp notte a 4 ° C con 50 microlitri / pozzetto di nucleosomi diluito in tampone di rivestimento. Suggerito diluizioni duplice serie di nucleosomi sono preparati dalla prima riga per riga in basso con l'aggiunta di 0,1 mg, 0,05 mg, 0.025 mg, 0,0125 mg, mcg 0,00625, 0,00313 mg, 0,00156 mg, con tampone di rivestimento solo (0 cromatina mcg) nella parte inferiore fila. (Nota: comprende piastra sono necessari per questo passaggio.) Al mattino, lavare i piatti 4 volte con 200 l / pozzetto PBS/0.5% di Tween-20 a temperatura ambiente (RT) per un totale di 10 min con una rondella di piatto. Blocco 1 ora a temperatura ambiente con 100 l / pozzetto PBS/0.05% di Tween-20 / 5% BSA. Rimuovere il tampone di bloccaggio agitando la piastra capovolta vivacementepiù di un lavandino. Coprire e conservare le piastre a -20 ° C, o andare direttamente alla fase successiva. Aggiungere 1 ° Abs in un volume di 50 microlitri / ben diluito 1:1000 (o secondo necessità) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA, incubare a RT per 1 ora su un rotatore. Lavare le piastre 4 volte con 200 l / pozzetto PBS/0.5% di Tween-20 a temperatura ambiente e per un totale di 10 min in una lavatrice piatto. Aggiungi rafano perossidasi di cavallo (HRP)-coniugato 2 ° Abs, diluito 1:5000 (o secondo necessità) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA a temperatura ambiente per un'ora su un rotatore. Lavare le piastre 4 volte con 200 l / pozzetto PBS/0.5% di Tween-20. Ogni lavaggio è a temperatura ambiente e per un totale di 10 minuti con una rondella di piatto. Sviluppare i piatti aggiungendo 50 l di substrato TMB ad ogni pozzetto per 10 minuti a temperatura ambiente. Bloccare la reazione aggiungendo 50 microlitri / pozzetto di 2N H 2 SO 4 e leggere le piastre 450 nm. (Suggerimento: Centrifugare a 1500 rpm per 2 minuti utilizzando un rotore piatto per dissipare eventuali bolle d'aria nei pozzetti prima assorbanze lettura). Esportare le letture ad un foglio elettronico per analisi quantitative e statistiche. Reagenti PBS / butirrato 135 mM NaCl 2,5 mM KCl 8 mM Na 2 HPO 4 1,5 mM KH 2 PO 4 10 mM Na-butirrato Lysis Buffer 250 mm di saccarosio 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 10 mM Na-butirrato 4 mM MgCl 2 0,1% Triton X-100 Tampone di lavaggio C 250 mm di saccarosio 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 10 mM Na-butirrato 4 mM MgCl 2 Saccarosio Cuscino 30% (w / v) di saccarosio nel tampone di lavaggio C Microccocal nucleasi Buffer 5 NaPO mm 4 tampone, pH 7,0 0,025 mm CaCl 2 Rivestimento tampone Soluzione A + 80ml 170ml Soluzione B + 250ml dH 2 O Soluzione A: 0,2 M Na 2 CO 3 Soluzione B: 0,2 M NaHCO 3 5. Rappresentante Risultati Utilizzando il NU-ELISA metodo, una serie di diversi piatti identici vengono preparati che possono essere caricati con cromatina preparato nella forma di mononucleosomes. Noi di solito preparare serie di identico-caricati piastre in modo che ciascuno può essere sondato con diversi anticorpi specifici anti-PTM (Abs). Abbiamo anche sempre preparare un piatto che può essere sondato con un Ab che rileva istoni senza riguardo al loro controllo totale stato di caricamento della cromatina modifica. Questo controllo è essenziale per poi confrontare quantitativamente contenuto PTM dei nucleosomi preparati da campioni diversi. Per quantificare i livelli di PTM all'interno di un campione di cromatina dato che correggere i valori di assorbanza prima con questo approccio: in primo luogo, si sottrae ogni segnale di fondo utilizzando i valori ottenuti da pozzetti di controllo che non contengono cromatina (sfondo di solito è trascurabile). Abbiamo poi standardizzare PTM-specifici segnali di NU-ELISA risultati ottenuti da una piastra identico carico che è stato testato con un Ab che rileva nucleosomi indipendentemente dal loro stato di modifica. (Abbiamo usato Abs policlonali specifici per gli istoni H2A e H2B per questo scopo). Siamo quindi determinare medie e le varianze per ogni diluizione della cromatina, e utilizzare i dati ottenuti dalla parte lineare del test ELISA. Esempi dettagliati di NU-ELISA analisi matematiche e statistiche sono state precedentemente riportate 4 Figura 1. Schematica diagam di NU-ELISA passi. A. Le cellule di mammifero vengono raccolte; B. I nuclei sono separati dalle cellule da Dounce homogenization, C. Turbativa cellule vengono caricati sulla cima di un 30% w / v cuscino di saccarosio, D. Dopo la centrifugazione, i nuclei si depositano nel pellet, E, F. cromatina sono digeriti in situ principalmente per mononucleomes da MNase, G, H , io. mononucleosomes solubili sono estratte da un trattamento ipotonico e centrifugazione ripetuta di residui di materiale nucleare. Mononucleosomes J. da diversi campioni (con etichetta samp. 1 e 2 in questo caso) sono rivestiti in pozzetti in serie di identico caricati piatti e interrogati con PTM-specifici Abs e PTM-Abs indipendente per determinare il carico totale della cromatina. Rappresentazione K. di livelli di segnale di rilevazione differenziale in due campioni che si differenziano per il loro contenuto PTM, ancora simile contenuto complessivo della cromatina, come giudicato da anti-H2B immunoreattività.