漂白后荧光标记蛋白的荧光恢复（FRAP）在培养海马神经元的树突棘

1。神经元转文化胚胎第18天（E18）大鼠海马神经元- D -聚赖氨酸包MatTek 35毫米的玻璃底菜 1 。 （DIV），在16-18天的体外转染的神经元，使用Clontech公司CalPhos哺乳动物转染试剂盒。首先，用1.5毫升培养基代替贝科改良Eagle培养基 （DMEM），每35毫米盘0.5小时之前转。 （步骤1.6）使用，保存在一个无菌的15毫升管的原培养液。 混合使用无菌H 2 O（Clontech公司）和12.4μL2米钙的解决方案（Clontech公司）的总体积100μL的10μg的pEGFP – N1质粒DNA。 从步骤1.2）中添加的混合物100μL2 ×哈佛商学院滴加而涡旋2 ×哈佛商学院在中等速度。 让坐在混合物在室温下放置20分钟，然后添加步骤1.3）DMEM培养液培养的神经元最终混合物。 为1-1.5小时，放入37℃培养箱中培养的神经元。 删除磷酸钙介质中，然后用DMEM三次洗细胞。在返回培养皿中的孵化器，交流与原培养液DMEM培养基。 2。在脊柱的FRAP实验用于转染后二至四天的FRAP实验的神经元。 从35毫米的玻璃底菜更换培养液，立即加入预热Tyrode液，其中包含（毫米），HEPES 10 5 145氯化钠，氯化钾，葡萄糖10，甘氨酸0.005，2.6氯化钙和氯化镁2 1.3（用NaOH调整pH至7.4）。 蔡司LSM 710共聚焦显微镜是用于FRAP实验。蔡司TempModule系统是用来控制温度（37℃），湿度和工作系统的CO 2（5％）。确保连接和一瓶水，这是用来平衡湿度，是装满了水，CO 2坦克。 查找100 ×目标（αplan的复消色差透镜100 × / 1.46油）的转染成熟树突。如果在盘转染细胞稀疏，寻找所需的细胞与40 ×的目标（计划NEOFLUAR 40 × / 1.3油），然后切换到100 ×目标捕捉图像。 使用5 ×光学变焦和256 × 256像素分辨率的图像一小段几个刺的枝蔓。要拍摄图像，使用额定转速（像素停留时间为3.15微秒）需要0.5秒完成扫描。针孔设置为2μm的获得较强的荧光。到图像时，尝试使用激光传输低，例如1-5％，以避免漂白的整个形象。 选择感兴趣的脊椎。在我们的实验中，我们选择与他们的脊柱头部直径约1微米的蘑菇刺。 为了做一个FRAP实验，漂白前5个控制影像，然后漂白脊柱利益标称100％激光传输的10倍[氩激光功率为30兆瓦，488激光线的50％（15毫瓦），和约3-4毫瓦，达到通过显微镜488激光线]，然后漂白后，立即捕捉了一系列的图像。在这个实验中，图像被捕获漂白后每15秒1秒。调整的时间间隔应根据不同的目标蛋白质和不同的实验设计（ 图1） 。 保存图像。 3。数据分析与ImageJ软件中打开图像。 对齐使用对齐工具图像的堆栈 – ImageJ（“插件”→“栈洗牌”→“对齐堆栈片”→“翻译”和/或“刚体”），使脊柱的利益不浮换句话说 – 它仍然在同一位置上的图像。 测量相对利益（F S）的脊椎，一个转，但漂白地区（对照组），在时间的推移图像和背景区域（F B）的荧光强度，使用ImageJ工具“力度V时间显示器”（ “插件“→”栈 – 洗牌“→”强度V时间显示器“）。控制区域可以是一个倍受关注的远端树突的一块。背景区是一个非荧光的地区。 计算前（F C0）和（F C）漂白后，通过比较控制区的荧光光漂白率（R ）。 R = F C / F C0。 目标脊柱的荧光强度（F）的规范如下： F =（F S – F B）/ R。 曲线拟合Graphpad Prism软件一阶段的指数方程（ 图2）或官方所用的荧光强度的目标脊柱ř类似软件。 计算移动的分数（F M）和不动的一小部分（一 ）由下列公式： F M = F∞/ F 0， 其中，F∞全面复苏后的荧光强度，F 0是前漂白的荧光强度。 F的第I = 1 – F 米。 4。代表性的成果： 在这项研究中，我们执行一个成熟的海马神经元的FRAP实验。在18-22格，已形成了蘑菇刺。用我们的方法，在一个小区域的荧光强度的动态变化，如脊椎，可以被记录下来。 要分析的EGFP荧光恢复过程中，我们采取控制之前，漂白和5张1图像的每1在15秒漂白后立即第二。图像分辨率是足够的定量分析。标记的荧光蛋白的荧光恢复型材高度重复性。 我们还简要说明如何定义一个荧光蛋白的移动和静止的分数，使用ImageJ和Graphpad Prism软件。我们在这里展示的FRAP方法和分析，可以广泛应用于神经科学，细胞生物学等研究。 图1。FRAP EGFP荧光测量在脊柱从培养的海马神经元。红色箭头指示的漂白时间。照片代表前同一地区（预），0，1，5，10，15秒​​后漂白。字母S，C和B，分别标有脊柱，控制和背景区域。在实验过程中，神经元保持在37 ° C。比例尺，1微米。 图2。FRAP EGFP荧光曲线超过15秒的时间。绿线显示了原始的曲线;红线显示正常化的曲线。曲线上的点显示FRAP每隔1秒。一个阶段的指数方程拟合曲线。漂白前的平均荧光计为100％。在这个实验中，移动的比例（MF）是94％，在不动的分数（IF）为6％。