Ортотопическая Xenografting прав люциферазы-меткой Злокачественные клетки периферической нервной оболочки опухоли для В естественных условиях Тестирование кандидата терапевтических агентов

1. Первоначальная подготовка без обнаженной иммунодефицитных мышей (не обязательно обнаженная штаммов): Все процедуры были рассмотрены и утверждены заранее, ЗАО Институциональные уходу и использованию животных комитетом и проводится должным образом подготовленный персонал. Мы успешно использовали три штамма иммунодефицитных мышей для этих экспериментов:) Фоксчейз беспородных SCID мышей (CB17/lcr- Prkdc SCID / lcrCrl мышей), б) NIH III мышей (NIHS-лизатора BG Foxn1 ню Brk XID мышей), а также с ) NOD-SCIDγ мышей (NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ мышей). В наших руках, рост ортотопической ксенотрансплантаты практически идентичны по NIH III и NOD-SCIDγ мышей, оба из которых носят мутации, влияющие функцию Т-клеток, В-клетки и НК-клеток, а для этого протокола, количество дней, необходимых для получения взяток роста, время, в которое терапия начата, и раз после прививки, когда изображения осуществляется в тех, которые мы эмпирически определяется с помощью NOD-SCIDγ мышей. Graft рост Фоксчейз беспородных SCID мышей, которые имеют дефекты в Т-и В-клеток, как правило, занимает больше времени. Для облегчения пересадки большого числа не-обнаженном иммунодефицитных мышей, мы удаляем волосы от места операции во второй половине дня до прививки. Мыши наркозом использованием изофлуран камере прилагается к индукции испаритель с мусор для отработанных газов. Для поддержания температуры тела, животных, обрабатываются на грелку на протяжении всего этого процесса. Машинки для стрижки используются для удаления волос с середины спины до колена задней ноги на стороне, которая должна быть привита. Любые оставшиеся волосы тщательно удалены с сайта в ~ 5 минут с помощью химического вещества для удаления волос (например, Наир, в частности, продуктов с алоэ вера для чувствительной кожи). Удаление удаления волос продукт рекомендуется, поскольку это может привести к раздражению кожи, глаз и других поверхностей тела, к которым она может распространяться. Мы не привитые и седалищного нервов в этих экспериментах, так как это может ухудшить двусторонние задних ног функции, что приводит к потере мышей из исследовательских групп. Мыши могут полностью восстановиться на грелку в изоляции клетку без постельного белья, это и гарантирует, что мыши не пострадали другие, более полно предупреждений животных и предотвращает их от случайного вдыхания постельных принадлежностей. Когда мышам полностью мобильным и не проявляют признаков опьянения, они могут быть вновь в клетку с другими мышами. 2. Подготовка MPNST клетки для инъекций в день прививки В этом протоколе конкретных цифр клеток привитых и время, необходимое для роста опухоли после прививки являются те, которые мы эмпирически определяется для ST88-14 ячеек, обычно используемых MPNST линию, которая была получена из NF1 связанных опухоли 5. Мы используем клетки для пересадки были трансдуцированных с лентивирусов вектор, содержащий ЦМВ-люциферазы-IRES-пуромицин кассету и клоны стабильно выражения люциферазы светляков определенных биолюминесценции изображений 6. Мы провели также эксперименты с прививкой MPNST клетки стабильно трансфицированных плазмид выражения люциферазы светляков под контролем CMV немедленного раннего промотора. Мы не рекомендуем делать это, как мы обнаружили, что эти векторы плазмиды склонны к вымиранию пройти выражения следующие прививки. ST88-14 клетки выращивают в минимальной необходимой среде Дульбекко с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мкг / мл стрептомицина и 10 МЕ / мл пенициллина (DMEM10); 5 мкг / мл пуромицин также входит поддержание отбора лентивирусов вектор. Мы поддерживаем эти клетки в нашей лаборатории в течение 50 пассажей и не наблюдал никаких изменений в рост клеток в любом из этих мест. 9 х 10 5 ST88-14 клетки помещают в колбу T175 и выращивали в течение 3 дней, после чего колбу около 80% вырожденная. Для трансплантата 35 мышей, одна 80% сливной T175 колбу не требуется; при этой плотности, наш средний выигрыш при ST88-14 клетки составляет 7,3 х 10 6 клеток на T175 колбу. Крайне важно, что клетки не могут расти до слияния перед сбором урожая для прививки. Мы обнаружили, что пересадка клеток, полученных из сливной результаты колбы в высокой степени трансплантата провал и часто продлевает в естественных ход трансплантата роста. ST88-14 клетки промывают один раз со сбалансированным солевым раствором комнатной температуры Хэнкса. Клетки удаляют из колбы использованием сотового Stripper клеточной диссоциации решение в течение 30 секунд до 1 минуты при комнатной температуре. Пять миллилитров DMEM10 (Примечание: пуромицин не входит в эту среду) за каждый миллилитр сотовый зачистки используются затем добавляют к клеткам. Клетки подсчитывают использованием гемоцитометра. 5 х 10 3 ST88-14 клетки приостановлен в 3 мкл будет выведена на мышь. Количество клеток достаточным привить всей когорты, с учетом пипетированияошибки (например, на 35 мышах, которые мы обычно передача количество клеток достаточным привить 40 мышей), переносят в стерильный 1,5 мл трубки. Клетки центрифугируют при 3000 оборотов в минуту в течение 5 минут. Супернатант тщательно удаляться, а клеточный осадок ресуспендировали в DMEM10 (Примечание: пуромицин не входит в эту среду) до конечной концентрации 5 х 10 3 клеток в 3 мкл. Держите клетки на льду. 3. Прививка протокола Мыши под наркозом в индукции палаты изофлуран испаритель, пока они не забирают свои задние конечности на стимул щепоткой пальцев. Мыши находятся на их стороне и вводят подкожно 0,05 мг / кг hydrocholoride бупренорфин. Анестезия при этом поддерживается с помощью непрерывного управления изофлюрана доставляется через носовой конус. Обратите внимание, что усыпляют мышей был использован, чтобы продемонстрировать эту процедуру для видео, следовательно, изофлуран трубы используются, чтобы предоставить изофлуран не видно в видео. Для поддержания температуры тела, животных, обрабатываются на грелку всей прививки процесса. Для предотвращения высыхания роговицы, небольшое снижение глазных мазей (Puralube ветеринарные мази) применяют для каждого глаза. Как это будет необходимо для каждой мыши, чтобы быть однозначно идентифицированы в ходе всего судебного, ухо тега уникальный идентификационный номер обрезается до правого уха каждой мыши. Место животного на животе, распространяя задних ног. Обложка мышь с стерильных драпировка, обнажив хирургических окна (фланге), где прививки не произойдет. Стерильной драпировки должны позволить визуализации голову, как обеспечить, чтобы нос по-прежнему внутри конуса, а также позволит контролировать дыхание и цвет животного. Применить бетадин на место операции с хлопком наконечником аппликатором, начиная с центра и постепенно фланге спирали наружу, чтобы края хирургического окна. 70% этанола, затем наносят на место операции в том же порядке. Последовательное применение бетадин затем этанолом повторяют еще дважды. Удалить клетки от льда и либо нежно вихрь или фильм трубки для ресуспендирования поселились клеток. Используя пипетку, удалите 3,2 мкл клеточной суспензии и извлечь его на кусок парафильмом. Удаляя больше, чем необходимо и размещение подвески парафильмом, мы можем гарантировать, что Есть нет пузырьков в подвеске и что у нас есть полная 3 мкл для инъекций. Вытяните столько клеточной суспензии возможно в 10 мкл шприца Гамильтона оснащен 33 иглы. Флик пузырьки из шприца и исключить избыточные суспензии клеток в точности 3 мкл. Держите клеток и клеточных содержащие шприц на льду до начала использования; для того, чтобы игла остается стерильным, не допускать контакта со льдом или ведро. Кусок Саран обернуть могут быть размещены в верхней части лед, чтобы шприц от прямого контакта льда. Использование № 4 Скальпель ручка оснащена № 22 лезвие скальпеля, сделать надрез через кожу фланга чуть ниже и параллельно бедренной кости; убедитесь, что разрез не выходит за пределы хирургически удалено поле. Открытый разрез кожи с хирургической зажим или вручную, чтобы разоблачить основные мышцы. Фасциальных плоскости будут видны вдоль длины ног; седалищный нерв лежит под этим, а также между двумя мышцами связанных фасции. Используя пару заостренные ножницами, тупая рассекают через этот фасции подвергать седалищного нерва, которое должно быть очевидно, как белый линейной структуры о толщине толстые нити. Используя пару заостренные изогнутые щипцы, осторожно рассекают под нерва, ослабление его от основной мышцы; это как возвышает и изолирует нервы. Оставьте щипцов под нерв сохранить эту позицию. Осторожно вставьте иглу шприца Гамильтона в нерв, пытается сохранить угол инъекции как параллельно с нервом, как можно так игла не прокол через нижнюю нерва. Игла должна быть вставлена ​​в конце нерва дистальнее позвоночника, мы обнаружили, что инъекции опухолевых клеток в нервные сторону спинного мозга устанавливает трансплантированных клеток опухоли в непосредственной близости к спинному мозгу. Когда это происходит, опухолевые клетки часто проникают в спинной мозг, что приводит к преждевременной потере животное от исследовательской группы из-за компромисса функции спинного мозга. Как только игла правильно расположен в нерв, расслабить напряжение производится в нерва щипцы и медленно вводят клетки из шприца в нерв более 45-60 секунд. Важно, чтобы это было сделано так быстро, медленно изгнание содержимого шприца приведет к "назад стирки" опухолевых клеток вокруг места инъекции и их потери. Ведь клетки были успешно вводят внутривенно, медленно извлеките иглу, чтобы минимизировать потери вводят материала. Удалить длябелые грибы и осторожно поместите нерва в исходное положение под мышцу. Закрыть хирургический разрез с Vetbond хирургического клея. Держите разрез вместе с пинцетом в течение приблизительно 20 секунд, чтобы клей для просушки. Мыши удаляется из изофлуран носовой конус и помещены один в кровати без клетки для восстановления. Это клетка должна находиться на вершине грелку, пока животное полностью выздоровел. Часть восстановления клетке не должно быть на грелку, это позволяет животному двигаться от тепла, если они получают слишком теплым. После прививки, животных следует оценивать регулярно для жевания на сайте, хромота или анорексия; эти признаки могут указывать на животных до сих пор от боли и, что надлежащий анальгетики должны быть заполнены. После обретения опыта с этой процедурой, мы обнаружили, что 30-40 мышей может быть легко привиты в течение одного дня. 4. Оценка Graft Успех и Рандомизация Into Исследовательских комиссий Биолюминесценция изображений используется для оценки успеха пересадки процедуры. Мы используем ИВИС-100 системы (родом из Xenogen, который теперь известен как Штангенциркули Inc) для обнаружения излучения света от опухоли выразил люциферазы светляков, которое производится в результате химической реакции люциферазы с ее субстратом, D-люциферин . Анализ этих изображений были ли конкретные привитых мышей подходят для вступления в терапевтических когорты суда. В предварительных экспериментах, мы количественно биолюминесценции сигналы обнаруживаются, пожертвовал привитых мышей, собранных их опухоли и опухоли коррелировала с весами биолюминесценции сигналы от интересующей нас области анализа с использованием программного обеспечения Жизнь Изображение производителя. Эти исследования показали, что существует линейная корреляция между опухоль весом трансплантата и излучение света биолюминесценции, указывая, что биолюминесценции визуализации соответствующего суррогатных средств оценки ксенотрансплантата роста на протяжении доклинических испытаний. Обычно мы Изображение 5 мышей в то же время. Дополнительная информация по биолюминесценции изображения были ранее опубликованы 7. Для оценки трансплантата успех, биолюминесценции изображений производится 1 и 3-х дней после прививки. Изображения собираются от мышей ориентироваться в таком же положении 10 мин после внутрибрюшинного введения 2,5 мг D-люциферин. Во время обработки изображений, мышей ведутся под изофлуран анестезии и их температура тела поддерживается на 37 ° С на грелку, присутствующих в тепловизор Xenogen. Раз Image Acquisition находятся в диапазоне от 2 секунд до 10 мин; программное обеспечение сбора данных гарантирует, что никакие пиксели насыщенных во коллекции изображений. Свечение опухоли регионов (относительно подсчета фотонов / сек) измеряется с помощью собственного программного обеспечения от Xenogen. Интенсивность света излучение представляет псевдо-масштабирование биолюминесценции, которая накладывается на черно-белых фотографий мышей, которые собираются в одно время. Чтобы иметь право на включение в доклинических когорты суда, мыши должны обнаружить сигнал биолюминесценции как 1 и 3 дня после прививки и интенсивность биолюминесценции сигнала должно увеличиться между днями 1 и 3. Животные, которые имеют сниженную или статический сигнал, исключаются. Кроме того, сигналы обнаружены у мышей, привитых в тот же день должна быть в пределах 1 на порядок друг от друга; мышей с биолюминесценции сигналы, которые на порядок ниже или выше, чем те, которые обнаружены у животных, привитых в тот же день, также исключены. После мышей были выявлены, которые отвечают этим критериям, они должны быть рандомизированы в группы лечения. Чтобы добиться этого, люциферазы сигналов, обнаруженных в привитых мышей 3-х дней после прививки сначала приказал от большего к меньшему интенсивности. Мыши затем рандомизированы в группы, назначая их в порядке интенсивности группах лечения, изменив этот порядок, а затем повторить процесс, пока все мыши относятся к группам. Например, если Есть 4 группах (например, плацебо и три концентрации испытуемого препарата) мыши относятся к группам в порядке 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 , 4, 4, 3, 2, 1 .. и т.д. Перед началом лечения, биолюминесценции сигналов, обнаруженных в каждый член группы назначен усредняются, чтобы убедиться, что в среднем, начиная сигналов внутри все группы как можно ближе. Администрация кандидата терапевтический агент начато на 3 день. Для оценки влияния терапевтический агент имеет на трансплантат рост в течение курса лечения, биолюминесценции изображений производится один раз в неделю после начала терапии (дни 10, 17, 24, 30 после прививки). Для не-обнаженном иммунодефицитных мышей, чрезвычайно важно, что у животных снова рост новых меховых удалены с Наир перед выполнением каждого изображения сессии. Это потому, что волосы блоков биолюминесцентного сигналов, с окрасом определения, какая часть сигнала теряется. Например, белый мех, как мы находим на швейцарском Webster мышей производит 18%-ное снижение интенсивности биолюминесценции сигнала 8, в то время как черный мех может уменьшиться сигналы столько, сколько 10-кратное 9. Мы также хотели бы отметить, что он не может предположить, что равномерное отрастание мех будет происходить во всех группах лечения и "нормализовать" Сигнал сокращения в группах. Это потому, что терапевтический агент сам может повлиять на рост волос. Например, мы отметили, что тамоксифен лечения подавляет рост волос, тем самым минимизируя воспринимается эффект этого препарата на рост опухоли по сравнению с плацебо мышей. С ST88-14 MPNST клеток мышей может быть осуществлена ​​в течение 30 дней после прививки. В это время, опухоли обычно выросли до максимальных размеров разрешено институционального ухода за животными и использование комитетов и должен быть принесен в жертву. После заключительной сессии изображений, мыши гибнут и образцы необходимых для дальнейшего анализа результатов лечения (например, кровь для определения уровня циркулирующего терапевтического агента, опухолевой ткани для определения веса, проверка гистология, определение Ki67 и индексы TUNEL маркировки и оценку биохимических параметров) собраны. Именно то, что образцы собраны будет зависеть от потребностей эксперимента. У мышей с опухолями должны контролироваться ежедневно и прекращается, если они заболевают (отсутствие нормального ухода и предотвращения поведения), не в состоянии есть или пить, или, если опухоль становится слишком большим, чтобы препятствовать нормальному движению тела. Опухоль бремя не должно быть позволено превышать 10% от нормального веса тела животного. Опухоль весом в процентах от массы тела рассчитывается путем сравнения веса опухоли животных подшипников весом от возраста / пола соответствие контрольных животных. Кахексия нельзя допустить, чтобы стать клинически значимым. Потеря веса в животных с опухолями, не должна превышать 20% от нормальной массы тела. 5. Представитель Результаты: На рисунке 1 показано типичное прогрессивное увеличение биолюминесценции наблюдается от 1 до 18 дней после пересадки в правильно ортотопической ксенотрансплантата в ню (NIH III), мышь (AC). Количественная оценка биолюминесценции сигналов, наблюдаемых 1-24 дней после прививки показывает, что хотя эти сигналы постепенно увеличиваться, рост опухоли значительно ускоряет в более поздних стадиях периода исследования (рис. 1D). Чтобы строго доказать, что рост опухоли произошло в привитых мышей, мы регулярно собираем седалищного нерва, и, если окажется, что опухоль имеет разрыв эпиневрий и вторглись в соседние ткани, окружающие мягкие ткани и скелетных мышцах. Учитывая агрессивный рост MPNSTs, это не удивительно, что мы часто обнаруживаем, что трансплантированных клеток опухоли нарушили нормальную барьеры нерва и вторглись в прилегающие ткани (рис. 1E). Кроме того, мы часто обнаруживаем, что трансплантированных клеток MPNST мигрировать агрессивно в нервные проксимальных и дистальных на трансплантат сайта. Рисунок 1. Биолюминесценция изображений NIH III мыши orthotopically привитые с люциферазы с метками MPNST клетки 1 день после прививки (А). Обратите внимание, что сигналы обнаружены в пределах области интереса (ROI) в различных мышей находятся в пределах одного порядка величины друг с другом. Reimaging 10 дней (В) и 18 дней (С) после прививки показывает, что биолюминесцентного сигналы постепенно увеличиваться трансплантата сайта в отдельных мышей. (D) график, иллюстрирующий постепенное увеличение относительной фотоотсчетов / сек обнаружено более трансплантата сайта 1-24 дней после прививки. (Е) Микрофотография трансплантата сайт из этой мыши продемонстрировав рост опухоли и координационные вторжения в соседние скелетных мышцах.