من مثلي Xenografting Luciferase الموسومة الإنسان الخبيثة ورم الخلايا العصبية المحيطية لغمد في الجسم الحي اختبار وكلاء المرشح علاجي
Summary
تم وصف طريقة لتطعيم موثوق بها الإنسان الخبيثة luciferase الموسومة غمد ورم الخلايا العصبية الطرفية في العصب الوركي العوز المناعي لدى الفئران. وتناقش أيضا استخدام التصوير تلألؤ بيولوجي لإثبات إنشاء السليم للترقيع الورم ومعايير العزل عشوائية من الحيوانات إلى مجموعات الدراسة.
Abstract
على الرغم من الشاشات في المختبر تعتبر ضرورية لتحديد أولية من وكلاء مرشح العلاجية ، وإجراء تقييم دقيق لقدرة الدواء لمنع ويجب أن يؤدي نمو الورم في نموذج حيواني مناسبة. نوع الحيوان الذي هو النموذج الأفضل لهذا الغرض هو موضوع للمناقشة مكثفة. بعض الأدلة تشير إلى أن التجارب قبل السريرية دراسة آثار المخدرات على الأورام التي تنشأ في الفئران المعدلة وراثيا هي أكثر التنبؤية لنتائج سريرية (1) وحتى يتم اختبارها في كثير من الأحيان وكلاء مرشح العلاجية في هذه النماذج. للأسف ، ونماذج معدلة وراثيا ليست متاحة لأنواع كثيرة من السرطان. مزيد من النماذج المعدلة وراثيا في كثير من الأحيان قيود أخرى مثل القلق بشأن كيفية جيدا نماذج ورم الماوس نظيرتها الإنسان ، وانتفاذ غير مكتملة من النمط الظاهري الورم وعدم قدرة على التنبؤ عندما الأورام ستتطور.
وبالتالي ، والمحققين استخدام العديد من النماذج طعم أجنبي (الخلايا السرطانية في الفئران البشرية المطعمة العوز المناعي) لتجارب قبل السريرية إذا كان ذلك مناسبا من النماذج الورم المعدلة وراثيا غير متوفرة. حتى لو النماذج المعدلة وراثيا متوفرة ، وتشاركت في كثير من الأحيان مع نماذج طعم أجنبي كدولة تسهيل التحديد السريع للنطاقات العلاجية. كذلك ، فإن هذه الشراكة تتيح للمقارنة بين فعالية عامل في الأورام المعدلة وراثيا وحقيقية الخلايا السرطانية البشرية. تاريخيا ، xenografting وكثيرا ما يقوم به عن طريق الحقن تحت الجلد خلايا الورم (xenografts خارج الرحم). هذا الأسلوب هو السريع واستنساخه ، وغير مكلفة نسبيا ، ويسمح الكميات المستمر للنمو الورم خلال فترة علاجية 2. ومع ذلك ، يمكن المساحة تحت الجلد ليست عادية بالنسبة لمعظم المكروية الأورام والنتائج التي تم الحصول عليها حتى مع xenografting خارج الرحم قد تكون مضللة نتيجة لعوامل مثل عدم وجود هيئة محددة من الأنسجة المضيف التعبير والجينات السرطانية. وهكذا كان من المستحسن أن يستعاض خارج الرحم أو ترقيع دراسات تستكمل الدراسات التي يتم فيها المطعمة الخلايا السرطانية في الأنسجة البشرية المنشأ (xenografting مثلي) 2. للأسف ، كثيرا ما أحبطت تنفيذ هذه التوصية من حقيقة أن مثلي منهجيات xenografting لم يتم تطويرها لأنواع كثيرة من السرطان.
غمد العصب المحيطي الخبيثة الأورام (MPNSTs) والأورام اللحمية شديدة العدوانية التي تحدث بشكل متقطع أو بالاشتراك مع نوع الورم العصبي الليفي 1 3 الأكثر شيوعا وتنشأ في العصب الوركي 4. نحن هنا وصفا لطريقة بسيطة من الناحية الفنية التي يتم فيها xenografted orthopically يراعة luciferase الموسومة MPNST خلايا الإنسان في العصب الوركي العوز المناعي لدى الفئران. وتناقش أيضا نهجنا لتقييم نجاح العملية تطعيم الحيوانات في الفردية والعشوائية لاحقة غير المنحازة إلى مجموعات الدراسة.
Protocol
Discussion
مثلي الطريقة التفصيلية xenografting المقدمة هنا هي تلك التي قمنا بتطويرها باستخدام الخلايا MPNST ST88 – 14 ، وهو الخط الذي يستخدم على نطاق واسع في الدراسات هذه NF1 المرتبطة غمد العصب المحيطي الأورام. ومع ذلك ، فإن هذه المنهجية هي قابلة للتكيف بسهولة مع غيرها من الدراسات قبل السريرية MPNST خطوط الخلايا. على سبيل المثال ، لقد قمنا أيضا مثلي xenografting مع الخلايا 10 STS – 26T ، وهو مشتق من الخط MPNST تحدث بشكل متقطع وT265 – 2C 11 الخلايا ، والتي هي مستمدة من MPNST NF1 المرتبطة ، مع نجاح مماثل لذلك لاحظنا مع ST88 -14 الخلايا.
وقد قلت ذلك ، فإننا نلاحظ أنه لا يمكن وصف الظروف الدقيقة ونحن هنا لمثلي من xenografting ST88 – 14 خلايا سيعتمد بشكل مباشر عن عمليات ترقيع للخطوط MPNST الأخرى. بدلا من ذلك ، لا بد من المعايير الأساسية لمنهجية تحديد تجريبيا لكل خط الخلية. وتشمل هذه المعايير عدد من الخلايا المطعمة MPNST في البداية ، والوقت المسموح به للتنمية الكسب غير المشروع ، وإلى حد أقل ، في وحدة التخزين التي يتم حقنها في الخلايا السرطانية. لإنشاء هذه المعلمات لسطر جديد ، ونحن مجموعة من الفئران الكسب غير المشروع (5 الفئران في كل مجموعة) مع 03 حتي 05 أكتوبر س خلايا الورم 6 10 ، والتحقق من الخلايا two تركيزات لكل أمر من حجم (أي 10 3 خلايا ، 5 × 10 3 الخلايا ، والخلايا 10 4 ، 5 × 10 4 خلايا ، الخ). يجب أن يتم حقنه أعداد أكبر من الخلايا السرطانية (> 10 6) في حجم أكبر ، ونحن قد وجدت التي يمكن حقنها يصل إلى 5 مل من دون خسارة من الخلايا العصبية من المطعمة. وقد وجدنا أيضا أنه يمكن حقن لا يزيد عن 5 × 10 6 خلايا الورم في حجم 5 مل تعليق أكثر كثافة كما أصبحت معرضة بشكل متزايد إلى القص الذي يقتل الخلايا السرطانية. نحن نتبع هذه الفئران على الأقل حتى ثلاثة حيوانات داخل كل مجموعة والأورام واضح ، وعند هذه النقطة لنا إنهاء هذه المجموعة ودراسة الأعصاب تشريحيا لتأكيد النمو الكسب غير المشروع. من الواضح ، والوقت المطلوب للوصول إلى هذه النقطة سوف تختلف ، اعتمادا على عدد من الخلايا حقن ، وبشكل عام ، ونحن نسعى للتركيز الخلايا التي ستصل إلى أقصى نمو الورم المسموح به خلال 30-60 يوما. ويمكن تحقيق المزيد من النمو السريع يجعل من الصعب تحقيق تركيزات علاجية فعالة قبل انتهاء فترة التجربة و / أو منع جمع ما يكفي من datapoints التصوير تلألؤ بيولوجي على مدار التجارب. دورة زمنية أطول من 60 يوما يجعل ضبط المعلمات التجريبية غير عملي وغير ضروري يطيل مدة التجارب المخطط لها.
أخيرا ، نود أن نشير أيضا إلى أننا قد استخدمت هذه المنهجية مثلي xenografting مع ST88 – 14 المطعمة الخلايا في الفئران الثالث المعاهد الوطنية للصحة للتدليل على فعالية العلاج من 6 تاموكسيفين. يمكن العثور على وصف تفصيلي للطرق التي نستخدمها بشكل روتيني لتقييم الآثار العلاجية وكلاء المرشح على xenografts مثلي في هذا المخطوط. كما أنها أثبتت أن الخلايا يمكن أن يفي عصبي المطعمة بنجاح في الأعصاب الطرفية 12 ، مما يشير إلى أنه ، مع بعض التعديلات ، ويمكن استخدامها للإجراءات المبينة في هذا البروتوكول لإجراء التجارب قبل السريرية مع وكلاء مرشح العلاجية الموجهة ضد الأورام الليفية العصبية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS048353 لSLC) ، والمعهد الوطني للسرطان (R01 CA122804 لSLC ، R01 CA134773 لكيفن روث ألف وSLC وCA13148 – 35 إلى KRZ) وإدارة الدفاع (X81XWH – 09 – 1 – 0086 لSLC). وقدمت صناديق دعم العملية الصغيرة من المركز الشامل للسرطان UAB الحيوان مرفق التصوير مشتركة من قبل لجنة التحقيق الوطنية منح الدعم الأساسية (P30 CA13148 – 35 ؛ E. الحجل ، PI). نشكر العصبية ألاباما مركز مخطط الأساسية (P30 NS57098) ، وعلم الأعصاب UAB مركز كور (P30 NS47466) لمساعدتهم. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو وزارة الدفاع.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Foxchase outbred SCID mice | Charles River | #236 | ||
| NIH III mice | Taconic | #NIHBNX | ||
| NOD-SCIDγ mice | Jackson Laboratories | #005557 | ||
| Cell Stripper | Fisher Scientific | 25-056-cl | ||
| Vetbond surgical glue | 3M | 1469SB | ||
| Hamilton syringe | Hamilton Company | #80030 | 10 μL volume | |
| Hamilton syringe needles | Hamilton Company | #7803-05 | 33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made) | |
| Ear tags | National Band and Ear Tag Co. | 1005-1 | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 |
References
- Rosenberg, M. P., Bortner, D. Why transgenic and knockout animal models should be used (for drug efficacy studies in cancer). Cancer Met. Rev. 17, 295-299 (1999).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Met. Rev. 17, 279-284 (1999).
- Carroll, S. L., Ratner, N. How does the Schwann cell lineage form tumors in NF1?. Glia. 56, 1590-1605 (2008).
- Woodruff, J. M., Kourea, H. P., Louis, D. N., Scheithauer, B. W., Kleihues, P., Cavenee, W. K. . Pathology and Genetics of Tumours of the Nervous System. , 172-174 (2000).
- DeClue, J. E. Epidermal growth factor receptor expression in neurofibromatosis type 1-related tumors and NF1 animal models. J. Clin. Invest. 105, 1233-1241 (2000).
- Byer, S. J. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth via an estrogen receptor-independent mechanism. Neuro-Oncology. , (2010).
- Zinn, K. R. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. Noninvasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice. Mol. Therapy. 4, 297-306 (2001).
- Luker, G. D., Leib, D. A. Luciferase real-time bioluminescence imaging for the study of viral pathogenesis. Methods Mol. Biol. 292, 285-296 (2005).
- Dahlberg, W. K., Little, J. B., Fletcher, J. A., Suit, H. D., Okunieff, P. Radiosensitivity in vitro of human soft tissue sarcoma cell lines and skin fibroblasts derived from the same patients. Int. J. Radiat. Biol. 63, 191-198 (1993).
- Badache, A., DeVries, G. H. Neurofibrosarcoma-derived Schwann cells overexpress platelet-derived growth factor (PDGF) receptors and are induced to proliferate by PDGF. BB. J. Cell. Physiol. 177, 334-342 (1998).
- Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells. Am. J. Pathol. 158, 501-513 (2001).
