1. RNA-extractie: cellen gekweekt in monolaag (Naar aanleiding van protocol van de fabrikant met behulp van TRIzol.) Naam van het serum Vennootschap Prod / Cat # TRIzol Solution Invitrogen 15596-018 Isopropylalcohol Sigma-Aldrich 1907-1964 Chloroform Sigma-Aldrich C 2432 Ethanol RNAse vrij water Homogenisering Homogeniseren cellen direct op de cultuur gerecht door toevoeging van 1 ml TRIzol Solution per 10 cm 2 schotel gebied, zwenk de TRIzol rond en pipet op en neer om een volledige dekking van de plaat te garanderen. Fasescheiding Incubeer het gehomogeniseerde monster gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Over in een gemerkte buis, voeg 0,2 ml chloroform per 1 ml TrizolSolution en schud tube met de hand gedurende 15 seconden. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten. Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 15 minuten bij 2 ° C. Na het centrifugeren van het mengsel scheidt in een lagere rode fase, een interfase en een kleurloze bovenste waterige fase, die de RNA bevatten en moet 60% van het totale TRIzol Solution volume. RNA Neerslag Breng de waterige, RNA bevattende fase in een frisse, gemerkte buis. Neerslag van de RNA door het toevoegen van 0,5 ml isopropylalcohol per 1 ml TRIzol Solution. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 minuten bij 2 ° C. RNA-wash Na centrifugatie, gooi het supernatans van de buizen. Was de RNA pellet (aan de zijkant en onderkant van de buis) door het toevoegen van tenminste 1 ml van 75% ethanol per 1 ml TRIzol Solution, vortex. Centrifugeer bij 7500 xg gedurende 5 minuten bij 2 ° C. RNA Elutie Verwijder het supernatant en centrifuge opnieuw gedurende 1 minuut. Verwijder veel vloeistof. De lucht drogen pellet gedurende 5-10 minuten. Let op: meer dan gedroogde RNA is moeilijk te lossen. Neem het pellet in RNase vrij water door pipetteren de oplossing up-en neer en gedurende 10 minuten bij 55 ° C incuberen Meet RNA-concentratie (A260/280 ratio) met behulp van een Nanodrop ™ spectrofotometer. Bewaren bij -80 ° C tot aan gebruik. 2. RNA-extractie: Serum (Naar aanleiding van Mirvana PARIJS Kit fabrikant het protocol van gemodificeerd door Mitchell et al. 1.) Naam van het serum Vennootschap Prod / Cat # Reacties mir Vana PARIS Kit 2X denatureren Solution Zuur-Fenol: Chloroform miRNA Wash Oplossing 1 miRNA Was Oplossing 2 / 3 Ambion AM1556 Gewijzigd protocol 2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522 Ethanol DEPC behandeld water Chemische Bereiding: Voeg 375 ul van 2-mercapto-ethanol aan de 2X denatureren Solution en meng goed. Voeg 21 ml 100% ethanol aan de miRNA wassen Oplossing 1. Voeg 40 ml 100% ethanol aan de miRNA wassen Oplossing 2 / 3. Monstervoorbereiding: Dooi serum monster op ijs. Homogenisering Meng 300 ul monster met een gelijke hoeveelheid (300 ul) van 2X denatureren Solution (moet op kamertemperatuur) en vortex. Incubeer mengsel op ijs gedurende 5 minuten. Voeg een volume van Zuur-fenol: chloroform die gelijk is aan het totale volume van het monster lysaat plus de 2X denatureren Solution (600 pi). Belangrijk: Gebruik NIET de waterige buffer dat ligt op de top van de Acid-fenol: chloroform. Vortex mengsel gedurende 60 seconden. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op maximale snelheid (> 10.000 xg). Na het centrifugeren van het mengsel scheidt in een bovenste waterige fase, een interfase en een lagere organische fase. Verwijder waterigelende laag bovenop (moet zijn 300 tot 500 ul met inbegrip van alle proteinacious "wazige" laag). Re-extract waterlaag als voorheen door opnieuw toe te voegen chloroform. Belangrijk: De waterige laag van de tweede extractie is routinematig kleiner in volume (250 ul). Noteer het volume hersteld. De voorbereiding van Final RNA-isolatie (totaal RNA) Pre-warmte (95 ° C) nuclease-vrij water. 100% ethanol moet op kamertemperatuur. Final RNA-isolatie (totaal RNA) Voeg 1,25 volumes van 100% ethanol om de herstelde waterfase (bijvoorbeeld als 300 ul werd teruggevonden, voeg 375 ul ethanol) en meng. Voor elk monster, plaats een filter patroon in een van de collectie buizen. Pipetteer het lysaat op de filter. Centrifugeer (10.000 xg) gedurende 30 seconden, gooi de doorstroom, centrifuge opnieuw gedurende 30 seconden en vervang de filter cartridge in dezelfde collectie buis. RNA-Wash Van toepassing zijn 700 ul miRNA Wash Solution 1 tot en met de filterpatroon en centrifugeer gedurende 15 seconden, gooi de doorstroom uit de collectie buis, en vervang de filter cartridge in dezelfde collectie buis. Van toepassing zijn 500 pi miRNA Was Oplossing 2 / 3, centrifuge gedurende 15 seconden, gooi de doorstroming en herhaal met een tweede 500 pi van Wash Oplossing 2 / 3. Gooi de doorstroom en droog-spin voor 1-2 minuten. Plaats filter in een frisse collectie buis, van toepassing 100 pi RNAse vrij water (95 ° C), sluit cap en incubeer gedurende 2 minuten. Centrifugeer voor ~ 2 minuten om het RNA te herstellen. Bewaren bij -80 ° C tot gebruik. 3. Concentratie van RNA-oplossing (5X) (Naar aanleiding van de fabricage van protocol) Naam van het serum Vennootschap Prod / Cat # Microcontroller centrifugaalfilter Devices, Ultracell YM-3 Millipore 42404 DEPC behandeld water Apparaat: Microcon Ultracell YM-3, Cutoff SS en DS Nucleotiden: 10 Volume: Gewenste volume van de re-RNA geconcentreerde oplossing is afhankelijk van experimenteel ontwerp en moet ook controle-experimenten. Plaats Microcon monster reservoir in flacon en pipet oplossing in het reservoir. Let op: raak het membraan. Centrifugeer voor 185 minuten bij 4 ° C met maximaal 14.000 x g. Let op: Plaats injectieflacon met crack band naar de rotor. Pipet gewenste volume van RNAse vrij water (bijv. 20 ul) op het reservoir, plaats reservoir omgekeerd in een nieuw flesje en de spin gedurende 3 minuten bij 4 ° C met maximaal 3000 x g. Bewaren bij -80 ° C tot gebruik. 4. Reverse transcriptie (Naar aanleiding van een protocol door Tang et al.. Twee met wijzigingen.) Naam van het serum Vennootschap Prod / Cat # Reacties Hoge capaciteit cDNA archief kit 10x cDNA archivering Buffer dNTP (100 mM) Moloney murine leukemie virus (MMLV) reverse transcriptase (50 U / pl) Applied Biosystems 4368814 gewijzigde protocol RNaseOUT (40 U / pl) Invitrogen 10777019 x-Plex reverse stam-lus primer mix (40 nM) * Integrated DNA Technologies Gewoonte Sequences * DEPC behandeld water Reactie Volume: 5,5 pl Let op: de uiteindelijke concentratie van de stam-lus primers moet worden 1-5 nM (hier 2 nM). Bereid Master-Mix (volumes per reactie) als volgt: 1. DEPC-Water 1.959 ul 2. 10x RT-Buffer 0,55 ul 3. RNase Inhibitor (40 U / pl) 0,0715 ul 4. dNTP (100 mM) 0.275 ul 5. x-Plex reverse stam-lus primer mix (40 nM) * 0.275 ul 6. MMLV-RT (50 U / pl) 0.369 ul Mix en centrifugeer kort. Voeg 3,5 ul Master-Mix tot en met 2 pl monster. Voer de volgende RT-reactie: 16 ° C gedurende 30 minuten, gevolgd door 60 cycli bij 20 ° C gedurende 30 seconden, 42 ° C gedurende 30 seconden, 50 ° C gedurende 1 seconde en tot slot 85 ° C gedurende 5 minuten om MMLV-RT, 4 inactiveren ° C ∞ . Bewaren bij -20 ° C tot gebruik. * Lijst van reverse stam-lus primers is te vinden op http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm 5. Pre-Amplification (Pre-PCR) (Naar aanleiding van een protocol door Tang et al.. Twee met wijzigingen.) Naam van het serum Vennootschap Prod / Cat # Reacties dNTP (100 mM) Applied Biosystems 4368814 Een hoge kap. cDNA archief Kit. 2x Universele PCR Master Mix met NoAmpErase UNG Applied Biosystems 4324018 x-Plex voorwaartse primer mix (450 nm) * Integrated DNA Technologies Gewoonte Sequences * Universal reverse primer (100 uM) Integrated DNA Technologies Gewoonte Sequence 2 AmpliTaqGold polymerase (5 U / pl) Applied Biosystems 4311806 MgCl 2 (100 mM) DEPC behandeld water Reactie Volume: 27.5μl (22μl MM + 5.5μl RT-Product) Let op: Pre-Amplification is nodig om de signaalsterkte te verbeteren, met name bij concentratie van het RNA is beperkt. De input RNA-niveau bepaalt het optimale aantal pre-PCR-cycli. Gezien de dezelfde relatieve efficiëntie elke PCR-cyclus moet het dubbele van de concentratie van het eindproduct. Omdat sommige miRNAs zullen meer hoog tot expressie, vermijd dan fietsen. Echter, onder-versterking resulteren in een verlies van detectie gevoeligheid, vooral voor microRNA's uitgedrukt op een laag niveau. In onze handen 12 pre-amplificatie cycli, met behulp van 100ng totaal RNA, bleek voldoende. Met behulp van serum als uitgangsmateriaal, 12 cycli resulteert in detecteerbare miRNA niveaus, maar 15 cycli bleek superieur. Tot slot, te beginnen met 3 eicellen (ongeveer 400 pg totaal RNA per eicel 3), 16 voorversterking cycli met succes konden we voor het screenen op microRNA expressie niveaus 4. * Lijst van forward primers is te vinden op http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Bereid Master-Mix (volumes per reactie) als volgt: 1. 2x Universele MM 13.75 ui 2. DEPC-Water 0.792 ul 3. MgCl 2 (100 mM) 0,55 ul 4. dNTP (100 mM) 1,1 pl 5. x-Plex voorwaartse primer mix (450 nm) 3,06 ul 6. Universal RP (100 uM) 1.375 ul 7. AmpliTaqGold polymerase (5 U / pl) 1.375 ul Meng en centrifugeer kort. Voeg 22 ul Master-Mix voor elke 5,5 ul RT-Product. Voer de volgende pre-PCR reactie: 95 ° C gedurende 10 min, 55 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd met 10 – 18 cycli van 95 ° C gedurende 1 s en 65 ° C gedurende 1 minuut, 4 ° C ∞. 6. Zuivering van het Pre-PCR-product Zuivering door grootte van selectie op een 10% inheemse polyacrylamidegel Naam van het serum Vennootschap Prod / Cat # 40% Acrylamide / Bis oplossing Bio-Rad 161-0144 TEMED Bio-Rad 161-0801 10 bp DNA ladder Invitrogen 10821-015 SYBR Gold nucleïnezuur gel vlek 10000 X concentreren in DMSO Invitrogen S11494 Glycogeen (20 mg / ml) Roche 10 901 393 001 Buffer-EB 10% Ammoniumpersulfate (APS) TEN-Buffer 6x Oranje G DEPC behandeld water ddH2O a. Gel Voorbereiding Om 10 ml van een 10% polyacrylamide mengsel toe te voegen te maken 1. DDH 2 O 6,5 ml 2. 10x TBE 1 ml 3. Polyacrylamide (40%) 2,5 ml 4. APS (10%) 80 pl 5. TEMED 4 pl Bereid DNA ladder: 0,5 ul 10 bp DNA ladder 4,5 ui Buffer (EB) 1 ui 6x Oranje G Voeg 5,5 ul 6x Oranje G op elke 27,5 ul Pre-PCR-product. b. Run Gel Run Gel met 150V voor 55-60 minuten. Let op: broomfenolblauw als indicator loopt met 20bp regio. c. Gel Stain Vlek gel met SYBR-Gold voor 25 minuten op shaker. Let op: SYBR-Gold is licht gevoelig. d. Cut Gel Knip Pre-PCR-product band 60 tot 80 bp en overdracht aan gemerkte buis. Opmerking: een band voor lage RNA-ingang Pre-PCR-producten misschien niet zichtbaar zijn. Crush gel band (bijv. buis in buis centrifugeren). e. Re-Extract cDNA Voeg 300 ul TEN-Buffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur op een rotator. Vloeistof naar een gemerkt collectie buis, een ander 300 ul TEN-buffer om de gel-bevattende buis toe te voegen en alles in een 4 incubeer ° C 's nachts op een rotator. Aspireren resterende vloeistof, over te dragen aan de gelabelde collectie buis als voorheen en noteer het totale volume hersteld. f. Ethanol Neerslag Voeg 3 volumes van de ruimtetemperatuur 100% ethanol. Voeg 0,5 ul Glycogeen (20 mg / ml). Vortex. Incubeer op droog ijs ten minste 2 uur of bij -80 ° C gedurende de nacht. Spin in microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 30 minuten om pellet cDNA. Dump vloeistof, voeg 700 ul kamertemperatuur 75% ethanol en spin gedurende 10 minuten. Dump vloeistof en spin weer voor 5 minuten. Suck uit bovenstaande vloeistof zonder storende pellet en drogen aan de lucht gedurende 10 minuten. Neem het pellet in schoon water. Let op: Gewenste volume van de geconcentreerde cDNA Solution is afhankelijk van experimenteel ontwerp en moet ook controle-experimenten. 7. Zuivering van het Pre-PCR-product Zuivering door enzymatische afbraak van primers, gevolgd door spin-kolom (volgens de fabrikanten protocollen) Naam van het serum Vennootschap Prod / Cat # ExoSAP-IT USB-Affymetrix 78250 MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Opmerking: In onze handen de exclusieve enzymatische clean-up succesvol verwijderd primers, maar ook geleid tot een gedeeltelijke afbraak van de pre-geamplificeerde product, mogelijk als gevolg van een gedeeltelijke denaturering van de korte producten als de temperatuur stijgt tot 80 ° C tijdens de inactivatie stap van de enzym. Het vermijden van warmte-inactivatie en direct het zuiveren van de PCR-producten uit de enzymatische reactie met behulp van spin-kolommen verwijdert alle primer zonder product degradatie. Mix 5 pi post-PCR-product met 2 pl ExoSAP-IT. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten om de resterende primers en nucleotiden af te breken. Voeg 5 volumes buffer PB tot een volume van de PCR-reactie en mix, als pH-indicator ik is toegevoegd aan PB Buffer, controleer dan of de kleur van het mengsel is geel. Plaats een MinElute kolom in een bijgeleverde 2 ml collectie buis in een geschikte rek. Breng het monster op de MinElute kolom en centrifugeer gedurende 1 minuut. Gooi doorstroom, terug te plaatsen van de MinElute kolom in de zelfde buis en voeg 750 ul buffer PE aan de MinElute kolom te wassen en centrifugeren gedurende 1 minuut. Gooi doorstroom en plaats de MinElute kolom terug in dezelfde buis. Centrifugeer de kolom voor een extra 1 minuut bij maximale snelheid. Plaats de MinElute kolom in een schoon 1,5 ml microcentrifugebuis. Te elueren DNA, voeg 10 ul DEPC behandeld water naar het midden van het membraan, laat de kolom staan gedurende 1 minuut, en dan centrifuge gedurende 1 minuut. 8. Fludigim 96.96 qRT-PCR Profiling Naam van het serum Vennootschap Prod / Cat # Reacties Fluidigm 96,96 Dynamic Array Kit 96.96 dynamische reeks 96.96 controle lijn vloeistof 20x laden Reagens Fluidigm Corporation Mix van Universal reverse primer (1 uM) Voorwaartse primer (1 uM) TaqMan Probe (0,2 uM) Integrated DNA Technologies Gewoonte Sequence (1) 2x Universele PCR Master Mix met NoAmpErase UNG Applied Biosystems 4324018 Tween 1. Het vullen van de 96,96 Dynamic Array IFC Injecteer controle lijn vloeistof (150 pi) in elk van de accu's op de chip. Plaats chip in de IFC (geïntegreerde vloeibare circuit) controller en start het Prime (136x) script aan premier controle lijn vloeistof in de chip. Let op: Chip moet worden gebruikt 24 uur na het openen van de verpakking. Zorg ervoor dat u de controle lijn vloeistof gemorst, omdat controle lijn vloeistof op de chip of in de kreken maakt de chip onbruikbaar. Chip moet worden geladen binnen 60 minuten na priming. 2. De voorbereiding van de monsters 2.1 Pre-Monstervoorbereiding In een wegwerp plastic buis, combineer de onderdelen in de tabel hieronder om de Sample-Pre-Mix (volumes per inlaat) te maken. 2x TaqMan Universal Master Mix 2,5 pl 20x laden Reagens 0,25 ul Let op: Final Volume is 2,75 ul, als overmaat van pipet afzien verliezen 2.2 Sample-voorbereiding Combineer in 96 goed elk monster-formaat met pre-sample mix (Volumes per inlaat). Pre-Sample-Mix 2,75 ul Monster 2,25 ul Let op: Vortex en centrifugeer 96 wells-plaat kort aan vocht te verzamelen. Eindvolume per inlaat 5 ul, neem pipetteren verlies in acht door het opstellen van iets hoger volume. 2.3 Voorbereiden van de 13x Assays Gebruik een 96 wells-plaat tot 13x assays voor te bereiden. 1x concentraties in de onderstaande tabel, op schaal voor 13x. Universal reverse primer 1 micrometer (1x) Volgorde in 2 Voorwaartse primer * 1 micrometer (1x) * Gen-Probe specifieke TaqMan # 0,2 micrometer # * Lijst van forward primers is te vinden op http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm # Lijst van TaqMan Probes is te vinden op http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Combineren in een nieuwe 96 wells plaat porties van de 13x testen met Tween voor een 0,25% Tween uiteindelijke concentratie van Let op: Final Volume per inlaat is 5 pl, voor te bereiden voldoende (5,5 pi) om het verlies te nemen tijdens het volume overschrijving op rekening. Meng goed, het vermijden van bubbels en centrifugeer kort om vocht te verzamelen. 3. Het laden van de chip Opmerking: Om te zorgen voor correct laden van monsters en analyses zorgen voor de juiste positionering van de chip. Het is handig om de inkeping af te stemmen op de linker bovenhoek. Zorg ervoor dat alle test-en sample oplossingen worden gemengd voor het laden van de chip. Het is handig om dit te doen in een 96 wells plaat en de plaat spin down voor het laden van de chip. Wees je bewust van de chip pipetteren kaart voor latere referentie. Ongebruikte monster inlaatbuizen moeten worden gevuld met 2,75 ul monster Mix en 2,25 ul DNA-vrij water. Ongebruikte assay inlaatbuizen moeten worden gevuld met 2,5 ul assay laad-reagens en 2,5 pl water. Ga niet voorbij de eerste stop, terwijl pipetteren te voorkomen dat er luchtbellen. Na het laden van de monsters en testen (VJaargang per inlaat: 5 pl) lopen de Load Mix script (136x) script om de monsters en analyses te laden in de chip. Nadat het script is voltooid, verwijdert u de chip van het ICF controller. Schil de blauwe beschermfolie van de onderkant van de geladen chip. Verwijder eventuele stofdeeltjes of vuil uit de chip oppervlak. 4. 96.96 qRT-PCR Breng de chip op de biomarkers systeem en gebruik de volgende versterking van de voorwaarden: 55 ° C gedurende 2 minuten, 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 s en 55 ° C gedurende 1 minuut. Volg de fabricage van protocol voor het verzamelen van data-software. 5. Met behulp van de qPCR analyse software Na de RT-PCR van de proprietary software biedt versterking bochten, warmte kaarten en Ct-waarden voor elke goed. Raadpleeg de softwarehandleiding voor data-analyse. 9. Representatieve resultaten: Figuur 1. Schematische weergave van de experimentele workflow. Afgebeeld is een stap-voor-stap beschrijving van de multiplex-PCR qRT protocol, met inbegrip van de zuivering (Stap E) van overmatige primers van multiplex reverse transcriptie (Stap C) en multiplex voorversterking (Stap D) voordat real-time detectie (stap F), wat resulteert in een gezuiverde cDNA template voor qRT-PCR. FP: microRNA specifieke voorwaartse primer, URP: universeel reverse primer, R-SLP: microRNA specifieke reverse stam-lus primer. Klik hier voor een grotere afbeelding. Figuur 2. . Polyacryamide gel zuivering van de qRT-PCR template na pre-PCR Bands van pre-PCR-product grootte zijn uitsluitend gezien in WT monsters, maar niet in microRNA gebrekkige DGCR8 – / – of Dicer – / – samples (pijlen) na 96-plex RT en 12 cycli van voorversterking. Merk op dat niet-specifieke producten van onbekende oorsprong (pijlpunten) en overmatige primers zijn te vinden in alle monsters (sterren). Figuur 3. Zuivering na multiplex voorversterking enorm nauwkeurigheid van qRT-PCR-resultaten verbetert a) Vergelijking van relatieve expressie van WT Mesc naar Dgcr8 -. / – (Canonieke microRNA deficiënt) Mesc onthult 1) de detectie van meer microRNA's en 2) het verlies van vals-positieve signalen in Dgcr8 – / – achtergronden na zuivering weg primers van de pre-PCR-product. b) Na zuivering, de relatieve expressieniveaus van zowel DGCR8 – / – / WT en Dicer – / – / WT tonen een verlies van vals-positieve signalen en zorgen voor een goede indeling van zeldzame Dgcr8 onafhankelijke / Dicer afhankelijk van kleine RNA's (miR-320, – 484, -877). 5 Figuur 4. Fluidigm high-throughput qRT-PCR miRNA profilering. Voorbeeld screenshot van 96.96 Fluidigm qRT-PCR mircoRNA profilering voor het screenen op verandering van miRNA niveaus van prostaatkanker patiënten sera. De real-time qPCR analyse-software biedt versterking curven, kleurgecodeerde heat maps en fietsen drempel (Ct).
