Intravital الميكروسكوب من العقدة الليمفاوية الأربي
Summary
ويرد تقنية لأداء المجهري intravital من العقدة الليمفاوية الأربية (LN). هذه التقنية تسمح في الوقت الحقيقي ،<em> في الجسم الحي</em> دراسة العقدة الليمفاوية microvasculature والهيكل على حد سواء خلال التوازن والعدوى. ويمكن تكييف هذه التقنية لدراسات الاتجار الخلية وغيرها من المواقع العقدة الليمفاوية.
Abstract
الغدد الليمفاوية (LN) ، وتقع في جميع أنحاء الجسم ، هي جزء لا يتجزأ من الجهاز المناعي. انهم بمثابة موقع لتحريض الاستجابة المناعية التكيفية ، وبالتالي ، وتطوير الخلايا المستجيب. على هذا النحو ، LNS هي المفتاح لمحاربة الجراثيم الغازية والحفاظ على الصحة. وأملت اختيار LN للدراسة والوصول النموذج المطلوب ، ويقع كذلك في العقدة الليمفاوية الأربية ، وتدعم دراسات بسهولة من النماذج ذات الصلة بيولوجيا من الجلد والالتهابات المخاطية التناسلية.
وLN الأربية ، شأنها شأن جميع LNS ، لديه شبكة واسعة الاوعية الدموية الدقيقة إمداده بالدم. بشكل عام ، وهذا يشمل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة شرين الوجبة الرئيسية للLN أن فروع في وقت لاحق والأعلاف الوريدات البطانية عالية (HEVs). HEVs متخصصة لتسهيل الاتجار الخلايا المناعية في LN خلال التوازن على حد سواء والعدوى. كيف HEVs تنظيم الاتجار في LN تحت كل هذه الظروف هو مجال التنقيب المكثفة. تغذية LN شرين ، لها تأثير مباشر على المنبع وHEVs هو الإمداد الرئيسي للمواد الغذائية والدم الغني الخلية في LN. وعلاوة على ذلك ، فإن التغييرات في تورط شرين الأعلاف في تسهيل تحريض الاستجابة المناعية التكيفية. وmicrovasculature LN له أهمية واضحة في الحفاظ على تدفق الدم إلى LN الأمثل وتنظيم تدفق الخلايا المناعية في LN ، والتي هي عناصر حاسمة في وظيفة LN السليم والاستجابة المناعية لاحقا.
القدرة على دراسة microvasculature LN في الجسم الحي هو المفتاح لتوضيح كيف يمكن لنظام المناعة وmicrovasculature تتفاعل وتؤثر على بعضها البعض داخل LN. هنا ، نقدم طريقة لتصوير في الجسم الحي من العقدة الليمفاوية الأربية. ونحن نركز على التصوير من microvasculature من LN ، مع إيلاء اهتمام خاص للطرق التي تضمن دراسة السفن صحية ، والقدرة على الحفاظ على التصوير من السفن قادرة على البقاء على مدى عدة ساعات ، والكمي لحجم السفينة. وتعرض أيضا أساليب لنضح من microvasculature بالأدوية فعال في الأوعية وكذلك القدرة على تتبع وقياس حركة المرور الخلوية.
Intravital المجهري للLN الأربية يسمح بتقييم وظائف الاوعية الدموية الدقيقة مباشرة في الوقت الحقيقي واجهة من واجهة مباشرة بين الخلايا المناعية ، LN ، ودوران الأوعية الدقيقة لل. هذه التقنية القدرة على أن تكون جنبا إلى جنب مع العديد من التقنيات المناعية والخلايا نيون وضع العلامات وكذلك التلاعب بها كما لدراسة الأوعية الدموية من LNS الأخرى.
Protocol
Discussion
المجهري Intravital من العقدة الليمفاوية الأربية المعروضة هنا يوفر القدرة على microvasculature صورة العقدة الليمفاوية في الجسم الحي ،. وهكذا ، فإنه وسيلة لتسهيل المراقبة المباشرة في الوقت الحقيقي. التصوير من microvasculature LN هو موقع الفريد الذي يسمح احد لدراسة العلاقة بين الاستجابة المناعية والأوعية الدموية و. باستخدام هذا الإعداد ، يمكن توجيه التركيز بشكل خاص على الاستجابة المناعية ، وتعديلات في الأوعية الدموية ، أو على التفاعل بين البلدين.
كما هو الحال مع جميع الأساليب التجريبية ، المجهري intravital القياسية على حد سواء مزايا وقيود. ويمكن بسهولة IVM القياسية ، مثل إعداد وصفها هنا ، يمكن تعديلها ، وثبت في السابق من قبل المؤلفين للسماح المجهري epifluorescent عبر إدخال التتبع الأصباغ الفلورية أو السكان الخلية المسمى. على الرغم من أن معيار IVM لا يعطي إمكانية التصوير ثلاثة الابعاد والتعقب مثل ستعطى من قبل اثنين من الفوتون المجهري أو تصوير الأوعية ، ويتحقق ما زالت تتبع خلية في بعدين السماح الخلية الى خلية والخلية إلى أن الأوعية الدموية التفاعل ولاحظ وكميا ، وبالتعاون مع الإدارة في الجسم الحي ، وتلطيخ لاحقة مع الأضداد الفلورسنت يمكن استخدامها لتقديم بيانات عن البروتين / علامة التعبير في الوقت الحقيقي.
خصوصا ، وتقنيات التصوير تتطلب بيئة بديلة للصور الثابتة ؛ لقط من منطقة العمليات الجراحية أو إضافة ساترة على إعداد شقة مطلوب بشكل متكرر. هذه الحدود ، إذا لم يحل ، والقدرة على يروي بنشاط وسطاء أو غيرها من الأوعية الدموية أكثر من إعداد لتقييم سلامة الأوعية الدموية وعلم وظائف الأعضاء أو غيرها في استخدام تقنيات أخرى مثل التجارب التي أجريت في إطار توسع الأوعية إعداد IVM. وعلاوة على ذلك ، ومعيار IVM لا تتطلب إعداد مسطح تماما والتي لا تتأثر الحركة ، مثل تلك التي تم إنشاؤها بواسطة التنفس من الحيوان. وهذا يسمح لاستخدامها IVM قياسية في مناطق أكثر الجراحية مع زيادة تكرارية. ويتجلى ذلك من خلال إعداد العقدة الليمفاوية الأربية الموصوفة هنا. نظرا لحجم وشكل العقدة الليمفاوية ، لا يمكن أن يتم إعداد شقة دون إصابة الأنسجة وموقع العقدة يثير الاقتراح كبيرة بسبب تنفس الحيوانات. ومثل هذه القضايا يكون من الصعب التغلب عليها عن طريق أساليب أخرى ، ولكن يتم التعامل بسهولة مع استخدام إعداد IVM القياسية وصفها.
باختصار ، يمكن الجمع بين إعداد المفصلة أعلاه مع أي عدد آخر من الكيمياء الحيوية ، والأوعية الدموية ، و / أو التقنيات المناعية مثل نقل أو مجموعات فرعية من تنشيط الخلايا المسمى ، تحريض نقص الأكسجين ، والإفراط في التعبير عن نفاد الوسطاء الأوعية الدموية. ومع ذلك ، تطبيقات إضافية تعتمد على الحالة الصحية للإعداد الأولي. لذا ، فمن الضروري دائما لاختبار صحة الأوعية الدموية التي يجري تصويرها وتقييمها. النقاط الرئيسية لتحقيق الصحة وإعداد ضمان perfused باستمرار مع إعداد PSS معايرتها في درجة حرارة الجسم والتقليل من الاتصال والتوتر وضعت على منطقة العمليات الجراحية أثناء الجراحة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة والمؤسسة الكندية للإبداع ، جامعة كولومبيا البريطانية مركز للبحوث وجامعة الدم قبل الميلاد الشمالية.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich |
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma Aldrich |
| Sodium Pentobarbitol |
References
- Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 561, 535-545 (2004).
- Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).
- Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle. Faseb J. 18, 280-286 (2004).
- Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
- de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer. Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).
- Domeier, T. L., Segal, S. S. Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries. J Physiol. 579, 175-186 (2007).
