El estudio de la integración de los adultos nacidos en las neuronas

1. Virus de la inyección Alto título de retrovirus modificados (1 x 10 9 unidades / ml) es producida por la co-transfección de vectores retrovirales y VSVG en las células HEK293T, seguido por ultracentrifugación de sobrenadante viral. Para las fuentes y los métodos de producción, de ver la demostración JoVe excelente (3). Nota: adultos jóvenes (4-6 semanas de edad) mujeres ratones C57BL / 6 (Charles River) se encuentran en condiciones normales. Todos los procedimientos siguen la guía del Consejo Nacional de Investigación para el cuidado y uso de animales de laboratorio bajo un protocolo aprobado por la Universidad de Stony Brook IACUC. 2UL deshielo de los retrovirus por animal congelado en el hielo. Anestesiar (100 mg de ketamina + 10 xilazina microgramos por gramo de peso corporal) y montar el animal en un marco estereotáxico (Steolting). Quitar el pelo en la cabeza y limpiar la piel con etanol al 70%. Exponer el cráneo y perforar cuatro pozos someros con un taladro dental (broca de 0,6 mm) en las siguientes coordenadas: anterioposterior = -2 mm de bregma, lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = 3 mm de bregma, lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm. anterioposterior = -2 mm de bregma, lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = 3 mm de bregma, lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm. Montar un Hamilton 1μl, plana punta de la jeringa e inyectar 0,5 l por retrovirus lugar a una tasa de 0,25 l / min en el giro dentado. (Ver las coordenadas por encima de la profundidad ventral.) Pausa 2 minutos después de cada inyección antes de retirar la jeringa lentamente para evitar el reflujo de líquido. Entre las inyecciones, una breve aclaración de la superficie externa de la punta de la jeringa con PBS estéril y un aplicador para eliminar los rastros de sangre. Cerrar la herida con material estéril sutura quirúrgica (tipo P-1; Tamaño 6-0) y devolver el animal a las condiciones de vivienda estándar hasta las etapas de tiempo deseado después de la inyección. 2. Preparación Cortar Para obtener cortes de alta calidad aguda de ratones adultos, se utiliza una solución de corte modificado para la preparación de corte (ver más abajo). Pre-corte chill solución a 0-4 º C en el hielo y la burbuja con un 95% de O 2 -5% de CO 2 por lo menos durante 30 minutos. Anestesiar y transcardially perfundir un animal con helado de oxígeno de una solución saturada de corte. Quite rápidamente el cerebro en un petri plato con papel de filtro pre-humedecido con una solución fría, oxigenada de corte. Cortar el cerebelo y la porción de una superficie de montaje de al menos 1 mm anterior a las coordenadas de la inyección (visible). Pegue el cerebro en una etapa vibrotome y montarlo en la cámara de corte llena con una solución de corte en frío y oxigenado. Prepare cortes coronales u horizontal (300-350μm) y la transferencia con una pipeta de mayor diámetro para una cámara de incubación a temperatura ambiente que contiene ACSF burbujas con un 95% O 2 / 5% CO 2. Incubar los cortes, burbujas de forma continua, a 32 ° C durante 30-60 minutos. Devolver la cámara a temperatura ambiente durante la duración de la grabación. 3. Los experimentos electrofisiológicos Los sectores se transfieren a la cámara de grabación que está continuamente perfundidos con ACSF saturada de oxígeno a 32 ° C – 34 ° C. Un electrodo de estimulación bipolar de tungsteno se coloca en la capa molecular del giro dentado con un objetivo de microscopio óptico bajo (10 veces). PED recién nacido en la zona sub-granular / capa de células granulares se identifican por la expresión de GFP o dTomato. De células enteras de grabación patchclamp se realiza en las neuronas recién nacidas bajo aumento (40X). Propiedades de disparo de las células registradas se obtienen mediante la inyección de una serie de corrientes en el modo actual-clamp. Estímulos eléctricos son entregados por el electrodo de estimulación a través de un aislador de la estimulación controlada por el software de grabación, y evocó las corrientes postsinápticas en el PED recién nacidos se registran. 4. Análisis de Datos Amplitudes de las respuestas evocadas postsináptica se analizan en las distintas fases de los adultos nacidos en las neuronas. 5. Resultados representante Utilizando el protocolo anterior, la expresión de GFP en el recién nacido neuronas giro dentado similar a la Figura 1 es común. Tenga en cuenta que las neuronas recién nacidas que es fácil ver y tanto dendritas y los axones están marcados con firmeza. Expresión en los axones delgados DGC y pequeñas espinas depende de la calidad y el título del virus, el promotor utilizado y la longitud de la expresión in vivo. En nuestras manos, las células del recién nacido y orgánulos subcelulares son generalmente visibles a los pocos días después de la inyección, y la expresión de la columna vertebral puede ser rastreado desde las primeras etapas de desarrollo. Wcélula-agujero grabaciones de las neuronas recién nacidas en las etapas de tiempo diferentes permitir el estudio de propiedades únicas células del recién nacido, por ejemplo, los potenciales de acción (figura 2a), así como el proceso de integración sináptica en los actuales circuitos neuronales durante la maduración (Figura 2b). Figura 1 de 2 fotones imagen confocal de neuronas recién nacidas en una sección horizontal de giro dentado de un ratón adulto. Las células verdes son 21dpi (días después de la inyección) que expresan GFP PED recién etiquetados con PUX-GFP retrovirus. Figura 2 a, b) Potencial de acción disparando propiedades de un recién nacido DGC a los 21 dpi.) Representante evocó excitatorios postsinápticos corrientes (EPSCs) grabado en un recién nacido DGC a los 21 dpi.