アダルト生まれのニューロンの統合を検討し

1。ウイルスのインジェクション高力価のエンジニアレトロウイルス（1 × 10 9単位/ ml）をウイルス上清の遠心分離に続いて、レトロウイルスベクターの同時トランスフェクションにより産生され、HEK293T細胞にVSVGています。源や生産方法については、優れたJoveのデモ（3）を参照してください。 注：ヤングアダルト（4-6週齢）雌のC57BL / 6マウス（Charles River）は、標準条件下で飼育されています。すべての手順は、ストーニーブルック大学のIACUCによって承認されたプロトコルの下で実験動物の管理と使用のための国立研究評議会のガイドに従ってください。 氷の上に動物あたりの冷凍レトロウイルスの融解2ul。 Anaesthetize（100μgのケタミン+グラム体重あたり10μgのキシラジン）と定位フレーム（Steolting）で動物をマウント。頭の毛を削除し、70％エタノールで皮膚を拭いてください。 頭蓋骨を公開し、以下の座標に歯科用ドリル（0.6ミリメートルドリルビット）を使用して、4つの浅い穴を開けます。 ブレグマからanterioposterior = -2ミリメートル、横= ± 1.6ミリメートル、腹側= 2.5ミリメートル、ブレグマからanterioposterior = -3ミリメートル、横= ± 2.6ミリメートル、腹側= 3.2 mmである。 ブレグマからanterioposterior = -2ミリメートル、横= ± 1.6ミリメートル、腹側= 2.5ミリメートル、ブレグマからanterioposterior = -3ミリメートル、横= ± 2.6ミリメートル、腹側= 3.2 mmである。 1μlのハミルトン、フラットチップシリンジをマウントし、歯状回の0.25μL/ minの速度でサイトあたり0.5μlのレトロウイルスを注入する。ゆっくり流体逆流を防ぐために注射器を引き出す前に、各注射後（腹側の深さについては、上記の座標を参照してください。）一時停止2分。注射の間で、簡単に滅菌PBSで注射器の先端部と血液の痕跡を除去するアプリケーターの外表面をすすぐ。 滅菌外科用縫合材料で傷口を閉じて（タイプP – 1;サイズ6-0）と注入後の希望の時間段階まで標準的な住宅の条件に動物を返します。 2。スライスの準備成体マウスからの高品質の急性スライスを取得するには、我々は（下記参照）スライス標本用に変更された最先端のソリューションを使用してください。 0〜4℃95％の氷とバブルのC O 2 -5％、少なくとも30分間CO 2へのプレチルカットソリューション。 Anaesthetizeとtranscardially氷冷酸素飽和切削液で動物を灌流。 迅速濾紙冷たい、酸素切削液であらかじめ湿らしたシャーレに脳を取り除く。小脳をカットオフし、（目に見える）注射の座標には、少なくとも1mmの前方の取り付け面をスライス。接着剤は、脳へvibrotome段階と寒さ、酸素切断溶液で満たされたカッティングチャンバにそれをマウントします。 冠状または水平スライス（300 -350μm）を作製し、室温ACSFを含むインキュベーションチャンバーに大口径のピペットでそれらを転送するには、95％O 2 / 5％CO 2をバブリング。 30〜60分間32℃でのスライス、連続的にバブリングし、インキュベートする。記録の期間のために室温にチャンバーを戻す。 3。電気生理学的実験 34℃ – スライスが連続して32℃で酸素飽和ACSFを灌流され、記録室に転送されます。 バイポーラタングステン刺激電極は、低倍率の顕微鏡対物レンズを（10X）を使用して歯状回の分子層に配置されます。 サブ粒状ゾーン/顆粒細胞層における新生児DGCsは、GFPまたはdTomatoの表現によって識別されます。全細胞patchclampの記録は、高倍率（40倍）下で新生ニューロンに実行されます。 記録された細胞の発火特性は、電流クランプモードの下での電流の一連の注入によって得られる。 電気刺激は、録音ソフトウェアによって制御される刺激アイソレータを介して刺激電極によって配信され、新生児DGCsにおける誘発性シナプス後電流が記録されます。 4。データ解析誘発シナプス後応答の振幅は、成人生まれのニューロンの異なる発達段階で分析されています。 5。代表的な結果上記のプロトコルを使用して、 図1と同様に新生児歯状回の神経細胞でGFPの発現は一般的です。新生ニ​​ューロンが容易に可視化すると樹状突起と軸索の両方が確実にラベル付けされることに注意してください。薄いDGC軸索と小さな棘の発現は、ウイルスの質と力価、使用されるプロモーターおよびインビボ発現の長さによって異なります。私たちの手では、新生児の細胞と副細胞小器官は、通常、注射後数日内に、可視、および脊椎の表現であり、開発の初期段階からたどることができます。 W別の時間段階で新生ニューロンからホールセル記録では、成熟（ 図2b）中に既存の神経回路に独自の新生児の細胞特性、例えば活動電位（ 図2a）、だけでなく、シナプス統合のプロセスの研究を可能にする。 図1成体マウスの水平方向の歯状回のセクションにおける新生児の神経細胞の2光子共焦点画像。緑色の細胞はPUX – GFPレトロウイルスで標識21dpi（日後に注入）GFP発現新生児DGCsです。 図2）アクション21解像度。Bにおける新生児DGCの潜在的な発火特性を）代表は21 dpiで新生児DGCに記録された興奮性シナプス後電流（EPSCs）を誘発。