वयस्क - जन्म न्यूरॉन्स की एकता का अध्ययन

1. वायरस इंजेक्शन उच्च टिटर इंजीनियर retrovirus (1 × 10 9 / इकाई मिलीलीटर) रेट्रोवायरल वैक्टर सह – अभिकर्मक द्वारा निर्मित है और HEK293T कोशिकाओं, वायरल सतह पर तैरनेवाला के ultracentrifugation के बाद में VSVG. स्रोतों और उत्पादन के तरीके के लिए, उत्कृष्ट जौव प्रदर्शन (3) देखें . नोट: युवा वयस्क (4-6 सप्ताह पुराना) महिला C57BL / 6 चूहों (चार्ल्स नदी) मानक शर्तों के तहत रखे जाते हैं. सभी प्रक्रियाओं देखभाल और Stony Brook विश्वविद्यालय IACUC द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद के गाइड का पालन करें. जानवर प्रति बर्फ पर जमी retrovirus का पिघलना 2ul. चतनाशून्य करना (100 μg + ketamine 10 ग्राम शरीर के वजन के प्रति μg xylazine) और एक stereotaxic फ्रेम (Steolting) पर जानवर माउंट. सिर पर बाल निकालें और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा पोछ लो. खोपड़ी बेनकाब और चार उथले निम्नलिखित निर्देशांक में एक दंत ड्रिल (0.6mm ड्रिल बिट) का उपयोग छेद ड्रिल: anterioposterior = bregma से -2 मिमी, पार्श्व = ± 1.6 मिमी, उदर 2.5 = मिमी, anterioposterior = bregma से -3 मिमी, पार्श्व = ± 2.6 मिमी, उदर = 3.2 मिमी. anterioposterior = bregma से -2 मिमी, पार्श्व = ± 1.6 मिमी, उदर 2.5 = मिमी, anterioposterior = bregma से -3 मिमी, पार्श्व = ± 2.6 मिमी, उदर = 3.2 मिमी. माउंट 1μl हैमिल्टन, फ्लैट – टिप सिरिंज और दांतेदार गाइरस में 0.25 μl / मिनट की दर पर 0.5 साइट प्रति μl retrovirus इंजेक्षन. (उदर गहराई के लिए ऊपर निर्देशांक देखें.) के धीरे सिरिंज द्रव backflow को रोकने के वापस लेने से पहले रोकें प्रत्येक इंजेक्शन के बाद 2 मिनट. इंजेक्शन के बीच, संक्षेप में बाँझ पीबीएस के साथ सिरिंज टिप और खून के निशान हटाने applicator की बाहरी सतह कुल्ला. बाँझ सर्जिकल सिवनी सामग्री के साथ घाव (P-1 प्रकार, 6-0 आकार) को बंद करें और मानक आवास की स्थिति के लिए इंजेक्शन के बाद वांछित समय चरणों जब तक पशु वापस. 2. स्लाइस तैयार वयस्क चूहों से उच्च गुणवत्ता वाले तीव्र स्लाइसें प्राप्त करने के लिए, हम टुकड़ा तैयार करने के लिए एक संशोधित काटने समाधान का उपयोग करें (नीचे देखें). पूर्व ठंड काटने 0-4 ° सी बर्फ और 95% के साथ बुलबुला पर 2% -5 हे कम से कम 30 मिनट के लिए सीओ 2 के लिए समाधान. चतनाशून्य करना और transcardially ठंडा ऑक्सीजन संतृप्त काटने के समाधान के साथ एक जानवर perfuse. जल्दी से एक पेट्री डिश में फिल्टर कागज ठंड, oxygenated काटने समाधान के साथ पूर्व गीला के साथ मस्तिष्क को हटा दें. बंद सेरिबैलम कट और इंजेक्शन (दृश्यमान) निर्देशांक के लिए कम से कम एक बढ़ते 1mm पूर्वकाल सतह टुकड़ा. गोंद मस्तिष्क पर एक vibrotome मंच और इसे काटने के चेंबर में ठंडा और oxygenated काटने के समाधान के साथ भरा माउंट. राज्याभिषेक या क्षैतिज स्लाइस (300 350μm) तैयार है और उन्हें एक बड़े बोर विंदुक के साथ एक incubating कमरे के तापमान ACSF युक्त चैम्बर हस्तांतरण 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ bubbled. 32 ° C पर 30-60 मिनट के लिए स्लाइस, लगातार बुदबुदाती, सेते हैं. रिकॉर्डिंग की अवधि के लिए कमरे के तापमान पर चैम्बर लौटें. 3. Electrophysiological प्रयोगों 34 डिग्री सेल्सियस स्लाइसें जो लगातार 32 डिग्री सेल्सियस पर ऑक्सीजन – संतृप्त ACSF साथ perfused रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित कर रहे हैं एक द्विध्रुवी टंगस्टन उत्तेजना इलेक्ट्रोड दांतेदार गाइरस की कम बढ़ाई खुर्दबीन उद्देश्य (10X) का उपयोग कर आणविक परत में रखा गया है. उप दानेदार क्षेत्र / दानेदार सेल परत में नवजात DGCs GFP या dTomato की अभिव्यक्ति के द्वारा पहचाने जाते हैं. पूरे सेल patchclamp रिकॉर्डिंग उच्च आवर्धन (40x) के तहत नवजात न्यूरॉन्स पर किया जाता है. दर्ज कोशिकाओं की फायरिंग गुण धाराओं की एक श्रृंखला के वर्तमान दबाना मोड के तहत इंजेक्शन द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. इलेक्ट्रिक उत्तेजनाओं उत्तेजना इलेक्ट्रोड से एक उत्तेजना रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित अलगाने के माध्यम से वितरित कर रहे हैं, और नवजात DGCs में postsynaptic धाराओं पैदा कर रहे हैं दर्ज. 4. डेटा विश्लेषण पैदा postsynaptic प्रतिक्रियाओं के amplitudes वयस्क जन्मे न्यूरॉन्स की विभिन्न विकासात्मक चरणों में विश्लेषण कर रहे हैं. 5. प्रतिनिधि परिणाम ऊपर प्रोटोकॉल का प्रयोग, नवजात दांतेदार गाइरस चित्रा 1 के समान न्यूरॉन्स में GFP अभिव्यक्ति आम बात है. ध्यान दें कि नवजात न्यूरॉन्स आसानी से कल्पना कर रहे हैं और दोनों dendrites और axons robustly लेबल रहे हैं. पतली क्लब axons और छोटे कांटा अभिव्यक्ति गुणवत्ता और वायरस के टिटर इस्तेमाल प्रमोटर और vivo अभिव्यक्ति में की लंबाई पर निर्भर करता है. हमारे हाथ में, नवजात कोशिकाओं और उप सेलुलर organelles आमतौर पर इंजेक्शन के बाद कुछ दिनों के भीतर दिखाई दे रहे हैं, और रीढ़ अभिव्यक्ति विकास के प्रारंभिक चरणों से पता लगाया जा सकता है. डब्ल्यूअलग अलग समय के चरणों में नवजात न्यूरॉन्स से होल सेल रिकॉर्डिंग परिपक्वता (चित्रा 2b) के दौरान मौजूदा तंत्रिका सर्किट में अद्वितीय नवजात सेल संपत्तियों, जैसे कार्रवाई क्षमता (2a चित्रा), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से synaptic एकीकरण की प्रक्रिया के अध्ययन की अनुमति देते हैं. चित्रा 1 2-photon एक वयस्क चूहे के एक क्षैतिज दांतेदार गाइरस अनुभाग में नवजात न्यूरॉन्स की confocal छवि. ग्रीन कोशिकाओं 21dpi हैं (दिनों के बाद इंजेक्शन) GFP-व्यक्त नवजात pUX – GFP retrovirus के साथ लेबल DGCs. चित्रा 2) लड़ाई संभावित 21 में एक नवजात क्लब के गुणों फायरिंग डीपीआई ख) के प्रतिनिधि उत्तेजक postsynaptic (EPSCs) धाराओं 21 डीपीआई पर एक नवजात क्लब पर दर्ज हुई .