Live-изображений PKC транслокации в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов
Summary
В этом видео, мы демонстрируем визуализации PKC транслокации в живых клеток с использованием флуоресцентной меткой PKCS.
Abstract
Протеинкиназа Cs (PKCS) являются серин треонин киназы, которые играют центральную роль в регуляции различных клеточных процессов, таких как рост клеток и обучения и памяти. Есть четыре известных семейств PKC изоформ у позвоночных животных: классический PKCS (α, Pi, βII и γ), новый тип я PKCS (ε и η), новый тип II PKCS (δ и θ), и атипичная PKCS (ζ и ι ). Классическая PKCS активируются Са 2 + и diacylclycerol (DAG), в то время романа PKCS активируются DAG, но Са 2 +-независимой. Атипичные PKCS активируются ни Са 2 +, ни DAG. В Aplysia californica, наша модель системы для изучения формирования памяти Существуют три нервной системы конкретного PKC изоформы по одному от каждой основной класс, а именно: обычные PKC Apl я, новый тип я PKC Apl II и атипичных PKC Apl III. PKCS это липидные активированной киназы и, таким образом активация классического романа и PKCS в ответ на внеклеточные сигналы неоднократно коррелирует с РКС транслокация из цитоплазмы в плазматическую мембрану. Таким образом, визуализируя PKC транслокации в режиме реального времени в живых клетках стал бесценным инструментом для выяснения сигнальных путей, которые ведут к активации ПКС. Например, этот метод позволил нам установить, что различные изоформы PKC перемещать в различных условиях посредничество различных типа синаптической пластичности и серотонина (5НТ) активация PKC Apl II требует производства как DAG и фосфатидной кислоты (PA) для транслокация 1-2. Важно отметить, что способность визуализировать же нейрон неоднократно позволило нам, например, для измерения десенсибилизации PKC ответ в изысканными деталями 3. В этом видео, мы демонстрируем каждый шаг подготовки Sf9 клеточных культур, культур Aplysia сенсорные нейроны были описаны в другой видео статьи 4, выражая флуоресцентно меткой PKCS в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов и жить-изображений PKC транслокации в ответ на различных активаторов использованием лазерной сканирующей микроскопии.
Protocol
Discussion
Мы описали технику изображения транслокации флуоресцентно меткой PKCS в реальном времени в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов. Sf9 клетки обеспечивают простую систему, чтобы изображение PKC транслокации с культивированием и трансфекции их довольно просто. В противоположность этому…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке канадских институтов здравоохранения (CIHR) Грант Wayne S. Sossin. Кэрол А. Фарах является обладателем докторской стипендий, начиная с де-ла-Fonds Recherche ан Santé Квебека (FRSQ) и Конрад Харрингтон общения. Авторы хотели бы поблагодарить Джоанна Бужи, Маргарет Гастингс и Маргарет Лаббан за помощь снимать видео и Мадлен Ричмонд бассейна за помощь в графическом обзоре.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | Gibco | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | Mattek | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100F-4 | Use to make microelectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Microelectrode holder | Tool | World Precision Instruments | MPH6S | Use to hold microelectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter | MP-85 | Use to position microelectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
