Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

Resumen: El protocolo se divide en cuatro partes. Parte 1 se describe cómo preparar la alimentación de las bacterias. La Parte 2 describe cómo preparar la lombricultura. Parte 3 describe la forma de puntuación vida. Parte 4 se muestran algunos resultados representativos, y la Parte 5 se describe cómo preparar las soluciones necesarias. Experimentos de vida útil tomar varias semanas para completarse. Para cada paso de la semana del protocolo, el día y hora del día se incluye para facilitar la planificación. La etapa L4 (día 0) se utiliza como punto de referencia para todo el protocolo. 1. Preparación de bacterias Alimentación En esta sección se describe la preparación de las bacterias de alimentación. Los objetivos específicos E. coli cepa utilizada para alimentar a C.elegans se llama OP50. Antes de este protocolo, para evitar la contaminación cruzada de la lombricultura con otras bacterias, la cepa OP50 se ha hecho carbenicilina / resistentes a la ampicilina 21. Preparar el OP50 cuatro a cinco días de antelación. Todos los materiales que entran en contacto con OP50 debe ser estéril. Día 7: jueves (semana 1): Inocular 5 ml de la tuberculosis con 100 mg / ml ampicilina y 0,1 mg / ml de anfotericina B con una sola colonia OP50 e incubar durante la noche a 37 ° C en un agitador de bacterias. -6 Día: viernes (semana 1). Mañana 08:30. Inocular temprano para dar tiempo suficiente para que la cultura para alcanzar la saturación Diluir el cultivo de una noche de OP50 1:2000 en TB 300 ml contiene 50 mg / ml de ampicilina. Incubar el cultivo de bacterias en un agitador durante 8-12 horas a 37 º C hasta que se alcanza la saturación. No permita que la cultura crezca más de 14 horas. Transferir el OP50 en un tubo estéril, centrifugación pre-ponderado. Se precipitan los OP50 por centrifugación durante 10 minutos a 3500 rpm (2.200 xg) en una centrífuga de mesa. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet OP50 en agua estéril y volver a una pastilla por centrifugación. Repetir este lavado dos veces. Tras el segundo lavado, retire con cuidado toda el agua restante. No se debe dejar el agua en el tubo. Pesar el tubo de centrifugación que contiene la pastilla y restar el peso del tubo de centrifugación vacío con el fin de determinar el peso de la pastilla. Bien volver a suspender el pellet en S-completa a una concentración de 100 mg / mL. No se debe dejar grumos. La concentración de 100 mg / mL OP50 debe corresponder a 2 x 10 10 bacterias / ml. El uso de un espectrómetro de fotos para determinar el número de bacterias por ml, si la relación entre la densidad óptica y el número de bacterias por mL se conoce. Si es necesario, ajustar la concentración de la solución de alimentación OP50 a 2 x 10 10 bacterias / ml. Guarde el OP50solution a 4 ° C hasta que se utiliza para el cultivo del gusano. 2. Preparación de una cultura del gusano síncrona En esta sección se describe la preparación de la lombricultura. Su objetivo es generar una población en edad sincrónica de los gusanos. Todos los materiales que entran en contacto con C.elegans después del tratamiento blanqueador en el paso 5, debe ser estéril. Las placas se mantienen a 20 º C a menos que se indique lo contrario. -6 Día: viernes (semana 1), 4:00 pm: Traslado de los animales a un plato fresco Tome un plato días 50-10 NGM de edad en la que la mayoría de la población del gusano consiste en larvas L1 de hambre. Esterilizar una espátula de metal por poco más de calor que un mechero de Bunsen. Deje que se enfríe. Use la espátula de refrigeración para cortar trozos de agar de la placa que contiene los gusanos de hambre. La transferencia de varios de estos trozos en una nueva placa de 10 cm NGM sembrado con OP50. Incubar durante aprox. 65 horas a 20 ° C hasta que la mayoría de la población de gusanos adultos se compone de gravidez. El tiempo necesario para que los animales muertos de hambre L1 se conviertan en adultos grávidas pueden variar de cepa a cepa. -3 Día: Lunes (2 semanas) 10:00 am: Establecer una población síncrono Recoger los gusanos de la placa de 10 cm, lávelos de la placa con 50-10 ml de agua estéril. Transferir la solución gusano / agua en un tubo cónico de 15 ml. Lavar los gusanos mediante la centrifugación de 2 minutos en una centrífuga de mesa a 1200 rpm (280 xg). Desechar el sobrenadante y agregar 10 ml de agua. Repetir. Aspirar el sobrenadante y añadir 5 ml de lejía recién preparada / solución de NaOH (2,5 cloro de uso doméstico ml, 1 ml NaOH 10N, 6,5 mL H 2 O). Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente hasta que los gusanos se abren. Asegúrese de vórtice suavemente cada minuto. Monitorear el progreso de la reacción bajo el microscopio de disección. Tan pronto como todos los adultos se disuelven, añadir 5 ml de buffer M9 para neutralizar la reacción. Lavar los huevos tres veces con 10 ml de buffer M9 mediante la centrifugación de 2 minutos a 2500 rpm (1100 xg). Lavar los huevos una vez con 10 ml S-completa mediante la centrifugación de 2 minutos a 2500 rpm (1.100 xg). Eliminar el sobrenadante, agregar 10 ml de S-completa y transferir la solución a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Añadir 30 ml de S-completa a un volumen final de 40 ml. Agite suavemente el tubo de la noche a temperatura ambiente en un nutator o dispositivo similar. Día -2: Martes (semana 2), 12:00 pm: La semilla de los animales en las placas Bajo el microscopio de disección, comprobar si los gusanos nacidos durante la noche. Determinar la concentración de los gusanos en la solución de S-completa, contando el número de gusanos en 10 gotas l usando un microscopio de disección. Contar con al menos 10 gotas de cada muestra. Vuelva a suspender los gusanos a una concentración de 80 a 100 lombrices / mL en el S-completo. Añadir carbenicilina (stock 100 mg / mL) a una concentración final de 50 mcg / ml y anfotericina B (stock 250 mg / mL) a una concentración final de 0,1 mg / ml. Agitar en un nutator. Si la preparación de grandes cantidades de gusanos, use un frasco de 600 ml Nunclon con la tapa del filtro. A las 2:30 pm agregar el OP50 preparados en la parte 1 a una concentración final de 6 mg / ml (= 1,2 x 10 9 bacterias / mL). Devolver el OP50 a 4 ° C. Transferencia de 120 l de la solución worm/OP50 en cada pocillo de una placa y 96. Use placas de 96 pocillos con fondo transparente. Asegúrese de mantener a los gusanos en la suspensión, mientras que la pipeta. Sellar la placa con un sellador de cinta para evitar la contaminación y la evaporación. Agitar la placa en un agitador de microplacas durante 2 min y se incuba durante 2 días a 20 ° C hasta que los animales llegan a la etapa L4. Día 0: jueves (2 semanas) antes del mediodía: Esterilizar los animales mediante la adición de fluorodesoxiuridina (FUDR) Para esterilizar a los animales añadir 30 l de una solución madre 0,6 mM FUDR a cada pocillo. En este paso el volumen final en cada pocillo a 150 l, y reduce la concentración final de OP50 de 6 mg / ml a 5 mg / ml (1×10 9 bacterias / mL). Sellar la placa con cinta de selladores y agitar durante 2-3 min en un agitador de microplacas. Si el OP50 se añadió a las 2:30 en el día -2, es importante que el FUDR se añade antes del mediodía. Volver placas a los 20 ° C incubadora Día 1: viernes (semana 2): Agregar a la cultura de las drogas A las 9:00 am la mayoría de los animales deberán ser grávidas y contienen varios huevos cada una. Añadir las drogas cuyo efecto sobre el ciclo de vida se va a probar en la concentración deseada. Si la disolución de la droga en las concentraciones de DMSO final de DMSO no debe ser superior a 0,6%, como las concentraciones de DMSO 0,6% más alto que acortan la vida útil C.elegans. Después de la adición de las drogas, sellar las placas con cinta selladora y agitar durante 2-3 min en un agitador de microplacas. Volver placas a los 20 ° C incubadora Adición de las drogas en ocasiones puede matar a algunos animales por plato, especialmente si se utiliza un solvente que el agua. El uso de un microscopio invertido para comprobar si hay animales muertos. Generalmente, no debe ser inferior a 10 animales muertos por placa de 96 pocillos. Volver placas a los 20 ° C incubadora. Día 4: Lunes (3 semanas): selladores de Cambio Para permitir que el oxígeno fresco entre la cultura de quitar el sellador, espere un minuto y vuelva a sellar la placa. Agitar la placa durante 2-3 minutos en un agitador de microplacas. Repetir una vez a la semana. Día 5: Martes (semana 3): Añadir nuevas OP50 para evitar el hambre Añadir 5 l de los 100 mg / mL OP50 solución que se preparó en una parte a cada uno de los 96 pozos para evitar el hambre. 3. La puntuación de vida. En esta sección se describe cómo la supervivencia de la población de lombrices sincronizado de la Parte 2 se controla hasta que los animales murieron. Para observar a los animales en el 96 y placas, el uso de un microscopio invertido con un objetivo de 2x o 2.5x. Registro de datos de supervivencia de tres veces a la semana, lunes, miércoles y viernes. Usar el movimiento para determinar si los animales están vivos o muertos. Una luz intensa, especialmente por la luz azul, induce a los animales a moverse. No retire los animales muertos de la prueba. De vez en cuando, los animales que no se movió y se determinó el número de muertos en la anterior podría pasar más adelante. En el día 0, al inicio del experimento contar el número total de gusanos en cada pozo. Censor pozos que contienen más de 18 animales a partir del análisis de los animales en estos pozos no tienen suficiente OP50 y mostrará los efectos de la restricción dietética. Con el fin de aumentar la probabilidad de que los animales se mueven, sacudir la placa de 96 pocillos en un agitador de microplacas durante 2 min. antes del conteo. En cada fecha de registro de conteo de sesiones y número de animales quese mueven como animales vivos. Movimiento en el líquido es mucho más fácil que en medio sólido y puede ser inducida por luz intensa. El uso de un mayor aumento puede ayudar a detectar movimientos muy sutiles, como los de la punta de la faringe. Estos movimientos sutiles son a menudo el movimiento sólo se observa en los animales muy viejos. Volver placas a los 20 ° C incubadora Repita el paso 2-4 cada dos o tres días hasta que todos los animales están muertos. 4. Los resultados representativos. En esta sección se muestra un ejemplo de cómo llevar un registro de los datos de esperanza de vida generada por este análisis y algunos resultados representativos. La figura 1A muestra un ejemplo de cómo registrar los datos de esperanza de vida durante este ensayo. Una hoja de Excel se utiliza para realizar un seguimiento de la supervivencia de las poblaciones en cada pozo. Para cada pozo es de coordenadas en la placa, la tensión, las drogas, la concentración de la droga y el número total de animales vivos en el día 0 (X0) se registra en el inicio del experimento. Fecha de registro, así como el número de animales muertos que viven y tres veces por semana para seguir a la supervivencia de las distintas poblaciones en cada pozo. Para graficar los resultados, calcular la fracción de animales vivos por cada día y la trama como una función del tiempo en días. P-valores deben ser calculados usando paquetes estadísticos como STATA o software similar. El medio de vida de C. elegans es dependiente de la temperatura. Figura 1B muestra que los cambios dependen de la temperatura en la longevidad se reproducen con precisión por la esperanza de vida basado en microtitulación ensayo 22. Del mismo modo, el ensayo de placa de microtitulación reproduce los cambios en la vida de los mutantes informó que tienen esperanzas de vida diferentes a los animales salvajes de tipo N2 23-24 25 (fig. 1C). El ensayo también puede utilizarse para hacer declaraciones más cuantitativo. En la media de Fig1D vida se representa como una función de la concentración mirtazepina 7. Cada punto representa la media de esperanza de vida de la población 7-12, cada uno vive de una manera diferente también. A pesar de que el número de animales por pozo es relativamente baja (5-15 animales) y la variación a pozo es relativamente pequeño, como puede verse en las barras de error. Figura 1. La placa de microtitulación basado vida ensayo reproduce con precisión los cambios en la esperanza de vida en la literatura. (A) los datos de la muestra recogida en una hoja de cálculo Excel. En cada fecha de la sesión de conteo, las coordenadas del bien y el número de animales vivos y los muertos se registró. Al comienzo del experimento, el número total de animales en cada pozo se determinó. (B) Curva de supervivencia de tipo salvaje (N2) animales criados a 20 ° C y 25 ° C. (C) Las curvas de supervivencia de las cepas con mutaciones que afectan a la vida. Las cuatro cepas se analizaron en paralelo a 20 ° C. (D) de la curva dosis-respuesta mirtazepina N2 animales tratados. La media de esperanza de vida se representa como una función de la concentración mirtazepina. Las barras de error indican el SEM de 8 pozos por condición. 5. Los materiales. M9 buffer, 1000 ml 6 g Na 2 HPO 4 3 g KH 2 PO 4 5 g de NaCl 0,25 g de MgSO 4 7H 2 O ∙ Añadir agua destilada hasta 1000 ml Autoclave Potassiumphosphate buffer de pH 6,0, 1000 ml 136 g KH 2 PO 4 Añadir agua desionizada hasta 900 ml Ajustar el pH a 6,0 con KOH 5M Añadir agua destilada hasta 1000 ml Autoclave Traza una solución de metal 1,86 g de Na 2 EDTA 0,69 g FeSO 4 7H 2 O ∙ 0,20 g MnCl2 ∙ 4H 2 O 0,29 g ZnSO4 ∙ 7H 2 O 0,016 g de CuSO4 1000 ml de agua desionizada Autoclave y almacenar en la oscuridad. S-basal medio, 1.000 ml 5,9 g de NaCl 50 ml de fosfato de potasio 1 M, pH 6,0 1000 ml de agua desionizada Autoclave Deje enfriar la solución y luego agregar 1 ml de colesterol 5 mg / mL (disuelto en Et-OH). 1M citrato de potasio, 1.000 ml 268,8 g de citrato tripotásico 26.3 monohidrato de ácido cítrico Añadir 900 ml de agua desionizada Ajustar el pH a 6,0 con KOH 5M Añadir agua destilada hasta 1000 ml Autoclave S-medio completo, 1.000 ml 977 ml S-basal 10 ml de potasio 1M citrato pH 6 (estéril) 10 ml de traza de metales solución (estéril) 3 ml de CaCl2 1M (estéril) 3 ml de 1M MgSO4 (estéril) NGM agar 3,0 g de NaCl 2.5g Pepton(A partir de la caseína, digerido pancreático) Agar 17g Añadir agua desionizada hasta 975 ml y una barra de agitación Autoclave Después del autoclave se enfríe a 55 ° C y añadir los siguientes componentes: 0,5 ml de 1 M de CaCl2 (estéril) 1 ml de colesterol 5 mg / ml en etanol 1 ml de 1M MgSO4 (estéril) 25 ml de tampón Potassiumphosphate, pH 6,0 (estéril) TB, 1000 ml 12 g de triptona Bacto 24 g de extracto de levadura 4 ml de glicerol Añadir 900 ml de agua desionizada Autoclave Después del autoclave se enfríe a 55 ° C y añadir los siguientes componentes: Añadir 100 ml de 0,17 KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 0,6 mM fluorodesoxiuridina (FUDR, Sigma cat # F0503), 1000 ml 100 mg FUDR Se disuelven en 670 mL estéril S-completa, hacer 10 o 45 ml alícuotas ml. Almacenar a -20 ° C. 100 mg / carbenicilina ml, 10 ml 1 g carbenicilina 10 ml de agua desionizada estéril Filtrado estéril y alícuota Almacenar a -20 ° C. Usar a una concentración final de 50 mg / ml 250ug / ml de anfotericina B, 4 ml 1 mg de anfotericina B 4 ml de Et-OH Almacenar a -20 ° C Usar a una concentración final de 0,1 mg / ml