قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا
Summary
في هذا البروتوكول نقدم طريقة لقياس<em> انواع معينة ايليجانس</em> عمر في 96 لوحات microtiter جيدا.
Abstract
عمر هو عملية بيولوجية التي تنظمها عدة مسارات الوراثية. استراتيجية واحدة للتحقيق في بيولوجيا الشيخوخة في دراسة الحيوانات أن الطفرات في مكونات الميناء من هم في سن التنظيمية المسارات. إذا كانت هذه الطفرات التشويش وظيفة مسار العمر التنظيمية وبالتالي يغير عمر الكائن الحي بأكمله ، لأنها توفر رؤى الآلية الهامة 1-3.
استراتيجية أخرى للتحقيق في تنظيم عمر هو استخدام جزيئات صغيرة لمسارات العمر التنظيمية التشويش. حتى الآن ، وتعرف على عدد من الجزيئات لتمديد عمر الكائنات الحية في نموذج مختلف ، وتستخدم كأدوات لدراسة بيولوجيا الشيخوخة 16/04. عدد من الجزيئات التي تم تحديدها حتى الآن هو صغير مقارنة مع "مجموعة أدوات" الجينية التي تتوفر لدراسة بيولوجيا الشيخوخة.
ايليجانس انواع معينة هي واحدة من حيث المبدأ النماذج المستخدمة لدراسة الشيخوخة بسبب الوراثة الممتازة والعمر قصير من ثلاثة أسابيع. في الآونة الأخيرة ، برز بوصفه الكائن C.elegans نموذجا للشاشات النمط الظاهري يستند 5،7،16-20 المخدرات بسبب صغر حجمها وقدرتها على النمو في لوحات microtiter.
نحن هنا تقديم مقايسة لقياس عمر C.elegans في 96 لوحات microtiter جيدا. كانت تجربة البلدان المتقدمة النمو واستخدمت بنجاح على شاشة كبيرة للمكتبات الجزيئات التي تمتد C.elegans عمر 7. وقد تم تقييم مدى موثوقية مقايسة في اختبارات متعددة : أولا ، عن طريق قياس عمر الحيوانات البرية نوع نمت في درجات حرارة مختلفة ، وثانيا ، من خلال قياس عمر المسوخ مع أعمار تغيير ، وثالثا ، من خلال قياس التغيرات في عمر ردا على تركيزات مختلفة من Mirtazepine المضادة للاكتئاب. Mirtazepine سبق ثبت لتمديد عمر في C.elegans 7. نتائج هذه الاختبارات تبين أن مقايسة غير قادرة على تكرار النتائج السابقة من فحوصات أخرى والكمي. تنسيق microtiter أيضا يجعل هذا الاختبار عمر الآلي متوافقة مع نظم مناولة السائل ، ويتيح الاندماج منصات الآلي.
Protocol
Discussion
قدمت بروتوكول يسمح بقياس عمر C.elegans في 96 لوحات microtiter جيدا. كما هو مبين في نتائج ممثل القسم أن يعيد موثوق النتائج السابقة ، ويوفر معلومات كمية. باستخدام هذا الاختبار وفحص أكثر من 89000 نجحنا جزيئات من حيث تأثيرها على عمر C.elegans.
لغرض فحص المخدرات ، وقياس عمر في 96 لوحة تنسيق جيد microtiter ديها العديد من المزايا خلال فحص وسائل الاعلام الصلبة الكلاسيكية. أنه يقلل من العمالة المطلوبة لإعداد وسائل الإعلام ، مقدار المساحة الحضانة ، وكمية المخدرات المطلوبة. شكل 96 – جيدا والإعداد المجهري تسمح أتمتة فحص كامل للعروض إنتاجية عالية.
خلال تطوير فحص قيم متعددة لكل متغير وخليط منها واختبارها لآثارها على عمر C.elegans. وشملت هذه الاختبارات OP50 تركيز مختلفة تتراوح من 3 إلى 10 ملغ / مل (3 ، 4 ، 6 ، 8 ، 10 ملغ / مل) ، عدد من الديدان المختلفة لكل بئر تتراوح بين 7 إلى 45 (7 ، 10 ، 15 ، 22 ، 45 الديدان / جيد) ، وأحجام مختلفة تتراوح الثقافة 40-150 ميكرولتر لكل بئر (40 ، 60 ، 80 ، 100 ، 120 ، 150 ميكرولتر) ، والتغيرات في تركيبة العازلة. إذا تم العثور على تغذية مع OP50 كربنيسيلين المقاوم ، لا كربنيسيلين ولا باء الامفوتريسين في تركيزات اشارت الى تؤثر C.elegans العمر. تم العثور على الهز المستمر لطيف من لوحات ، على النحو الموصى به في كثير من الأحيان في الثقافة C.elegans السائل ، والاستغناء عن وحدات التخزين الصغيرة المستخدمة في هذا الاختبار. تهتز لطيف ولكن إذا كان هناك حاجة لوحات microtiter مع أكبر الآبار لاستخدامها. وأشار القيم في هذا البروتوكول قد تم اختيارها بعناية على أساس المقارنة الإحصائية لظروف مختلفة اختبارها.
الميزة الأكثر إثارة للدهشة من هذا الاختبار هو على الأرجح أنه يمكن الاحتفاظ C.elegans في 96 لوحات جيدا أن ومختومة بالشمع. لم جنبا إلى جنب مقارنات لم تكشف عن أي اختلاف في عمر الحيوانات المستزرعة في لوحات تفض ، في لوحات مختومة مع السداده البلاستيك ، أو في لوحات مختومة مع السدادات التي تتيح تبادل الهواء. في جميع الحالات الثلاث ، وضعت الحيوانات متجانس جدا من L1 حامل للبالغين في غضون 65 ساعة وأظهرت أعمار مماثلة للغاية. وضعت الحيوانات نمت بالتوازي على NGM أسرع قليلا ، ولكن هذا الاختلاف كان مستقلا من غياب أو وجود السداده.
ويستند البروتوكول عرضت على البكتيريا الحية ، ولكن يمكن تكييفها للبكتيريا ميتة. ومع ذلك ، في فحص السائل يمكن لبكتيريا واحدة على قيد الحياة تتكاثر بسرعة وإعادة ملء الثقافة. في أيدينا ، والطريقة الوحيدة التي يعول عليها لقتل البكتيريا إلى حد أنه يمكن استخدامها للثقافة السائل هو عن طريق العلاج لفترات طويلة من البكتيريا مع أشعة غاما.
نقطة واحدة من المهم النظر في التخطيط لتجربة عمر هي قوة الكشف. اعتمادا على حجم التأثير ، لا بد من اختبار تأثير المخدرات من اهتمام في آبار متعددة. في مقايسة 4 نموذجية للأدوية المعالجة ومراقبة الآبار 4 ، الموافق 40-50 تقريبا كل الحيوانات ، يجب أن يكون كافيا للكشف عن زيادة بنسبة 30 ٪ في عمر في أكثر من 95 ٪ من التجارب. يتم الكشف عنها إلا زيادة قدرها 14 ٪ في 60 ٪ من الحالات ، وبالتالي تتطلب المزيد من الآبار تكرار.
ويمكن استخدام ثروة من البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة عمر هذا الاختبار لتطوير تجربة أو سلالة معينة من النماذج إن السفارة parametrical 1. هذه النماذج إن السفارة هي مفيدة لتحديد قوة الكشف وتقدير عدد من ايجابيات وسلبيات كاذبة على نطاق واسع الشاشات. علينا التحقق من التوقعات من هذه النماذج في التجارب الأعمى واستخدموه لتقدير أعداد من السلبيات كاذبة في شاشات كبيرة (نتائج غير منشورة).
باختصار ، نحن نتوقع أن يقدم مقايسة سيكون ذات فائدة كبيرة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تمتد من عمر C.elegans ودراسة الآليات الكامنة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وضعت أصلا من هذا البروتوكول في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان في سياتل ويي Xiaolan Petrascheck مايكل في مختبر ليندا باك. وقد أعد هذا الإصدار المفصلة أعلاه إلى اتخاذ جميع الإجراءات المتاحة للالمجتمع الأوسع. نشكر كارول تايلور ، LeBoeuf سارة وTomacelli اندي لقراءة نقدية للبروتوكول. هذا المخطوط # 2866 من معهد سكريبس للأبحاث. ويتم تمويل مختبر Petrascheck بواسطة برنامج ADI نوفارتيس.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Amphotericin B | Calbiochem | cat# 171375 | Also called Fungizone | |
| FUDR | Sigma-aldrich | cat# F0503 | FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water | |
| Mianserin | Sigma-aldrich | M2525-250MG | Use as positive control at 50μM final concentration | |
| Cyproheptadine | Sigma-aldrich | cat#C6022-MG | Alternative positive control at 10 μM final concentration | |
| Sealing Tape | Nunc | cat# 236370 | Polyester, non-sterile | |
| 96 well plate | Falcon | cat# 351172 | Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene | |
| Nunclon flask | Nunc | cat# 178883 | used for large volumes |
References
- Johnson, T. E. Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging. Science. 249, 908-912 (1990).
- Kenyon, C. J. The genetics of ageing. Nature. 464, 504-512 (2010).
- Finch, C. E., Ruvkun, G. The genetics of aging. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).
- Wilson, M. A. Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5, 59-68 (2006).
- Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307, 258-262 (2005).
- McColl, G. Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).
- Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 553-556 (2007).
- Srivastava, D. Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans. Biogerontology. 9, 309-316 (2008).
- Wood, J. G. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430, 686-689 (2004).
- Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan. Aging Cell. 7, 305-317 (2008).
- Onken, B., Driscoll, M. Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1. PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).
- Wu, Z. Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).
- Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. Life extension in Drosophila by feeding a drug. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).
- Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster. Biogerontology. 11, 45-52 (2010).
- Melov, S. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289, 1567-1569 (2000).
- Benedetti, M. G. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).
- Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson’s disease for high-throughput drug screenings. Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).
- Kwok, T. C. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Moy, T. I. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
- Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
- Lakowski, B., Hekimi, S. Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes. Science. 272, 1010-1013 (1996).
