Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Resumo: O protocolo é dividido em quatro partes. Parte 1 descreve como preparar as bactérias alimentação. Parte 2 descreve como preparar a cultura worm. Parte 3 descreve como pontuação vida. Parte 4 mostra alguns resultados representativos, e Parte 5 descreve como preparar as soluções necessárias. Experimentos vida levar várias semanas para ser concluído. Para cada etapa da semana de protocolo, dia e hora do dia está incluído para facilitar o planejamento. O estágio L4 (Dia 0) é usado como ponto de referência para todo o protocolo. 1. Preparação de bactérias que se alimentam Esta seção descreve a preparação das bactérias alimentação. O E. específicas coli cepa utilizada para alimentar C.elegans é chamado OP50. Antes deste protocolo, para evitar a contaminação cruzada da cultura verme com outras bactérias, a cepa OP50 foi feito carbenicilina / Ampicilina resistentes 21. Prepare o OP50 4-5 dias de antecedência. Todos os materiais em contacto com OP50 devem ser estéreis. Dia -7: quinta-feira (1 semana): Inocular 5 ml de TB contendo 100 mcg / ml ampicilina e 0,1 mcg / ml anfotericina B com uma colônia OP50 única e incubar durante a noite a 37 ° C em um agitador bacteriana. Dia -6: sexta-feira (1 semana). 8:30 da manhã. Inocular cedo para dar tempo suficiente para a cultura para atingir a saturação Diluir a cultura da noite para o dia OP50 1:2000 em 300 TB mL contendo 50 mcg / ml ampicilina. Incubar a cultura em um shaker bacteriana por 8-12 horas a 37 ° C até à saturação é atingido. Não permita que a cultura a crescer mais de 14 horas. Transferir o OP50 em um tubo de centrifugação estéril, pré-ponderada. Pellet o OP50 por centrifugação por 10 min a 3500 rpm (2200 xg) em uma centrífuga de mesa. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet OP50 em água estéril e re-pellet por centrifugação. Repita esta lavagem duas vezes. Depois da segunda lavagem, retire cuidadosamente toda a água restante. Nenhuma água deve ser deixado no tubo. Pesar o tubo de centrifugação contendo o pellet e subtrair o peso do tubo de centrifugação vazia, a fim de determinar o peso do sedimento. Completamente re-suspensão do sedimento em S-completa para uma concentração de 100 mg / mL. Não aglomerados deve ser deixado. A concentração de 100 mg / mL OP50 deve corresponder a 2 x10 10 bactérias / mL. Use um espectrômetro foto para determinar o número de bactérias por mL, se a relação entre a densidade ótica eo número de bactérias por mL é conhecido. Se necessário, ajustar a concentração da solução de alimentação OP50 a 2 x10 10 bactérias / mL. Armazenar os OP50solution a 4 ° C até ser utilizado para a cultura worm. 2. Preparação de uma Cultura Worm Synchronous Esta seção descreve a preparação da cultura worm. Seu objetivo é gerar uma população em idade síncrona de worms. Todos os materiais em contacto com C.elegans após o tratamento de lixívia na etapa 5 devem ser estéreis. Placas são mantidos a 20 ° C salvo indicação em contrário. Dia -6: sexta-feira (1 semana), 16:00: Transfer os animais para um prato fresco Dê uma placa NGM 50-10 dias de idade em que a maioria da população sem-fim consiste de larvas L1 fome. Esterilizar uma espátula de metal por pouco tempo de aquecimento é mais um bico de Bunsen. Deixe esfriar. Use a espátula resfriado a cortar pedaços de agar da placa contendo os vermes famintos. Transferência de vários desses pedaços em uma nova placa de 10 centímetros NGM semeados com OP50. Incubar por aprox. 65 horas a 20 ° C até que a maioria da população sem-fim é composto por adultos gravídico. O tempo que leva para os animais L1 fome para crescer em adultos gravid pode variar de cepa para cepa. -3 Dia: segunda-feira (2 semanas) 10:00: Estabelecer uma população síncrona Coletar worms da placa de 10 cm, lavando-as fora do prato com água mL 10/05 estéril. Transferir a solução worm / água em um tubo cônico de 15 mL. Lave os vermes por centrifugação 2 min em uma centrífuga de mesa em 1200 rpm (280 xg). Elimine o sobrenadante e adicionar 10 mL de água. Repetir. Remover o sobrenadante e adicionar 5 mL de lixívia preparada / solução de NaOH (2,5 lixívia mL, 1 mL de NaOH 10N, 6,5 mL H 2 O). Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente até que os vermes abrir. Certifique-se de vortex suavemente a cada minuto. Monitorar o progresso da reação sob o microscópio de dissecação. Assim que todos os adultos se dissolver, adicionar 5 mL de tampão M9 para neutralizar a reação. Lave os ovos três vezes com 10 mL tampão M9 por centrifugação 2 min a 2500 rpm (1100 xg). Lave os ovos uma vez com 10 mL S-completo por centrifugação 2 min a 2500 rpm (1100 xg). Remover o sobrenadante, adicionar 10 mL S-completo e transferir a solução para um tubo cônico de 50 mL fresco. Adicionar 30 mL de S-complete para um volume final de 40 mL. Agite suavemente o tubo durante a noite a temperatura ambiente em um nutator ou dispositivo similar. Dia -2: terça-feira (2 semanas), o meio-dia 12:00: Seed os animais em placas No âmbito de dissecação, verificar se os vermes nascidos durante a noite. Determinar a concentração de worms na solução S-completo por contagem do número de worms em 10 gotas mL usando um escopo de dissecação. Contar, pelo menos, 10 gotas para cada amostra. Re-suspender a worms em uma concentração de 8-10 worms / mL em S-completa. Adicionar carbenicilina (stock 100 mg / mL) a uma concentração final de 50 mcg / mL e anfotericina B (stock 250 mcg / mL) para uma concentração final de 0,1 mg / mL. Agitar em um nutator. Se preparando quantidades maiores de vermes, use um frasco de 600 mL nunclon com tampa de filtro. Em 2:30 adicionar o OP50 preparada na parte 1 para uma concentração final de 6 mg / mL (= 1,2 x10 9 bactérias / mL). Devolver o OP50 a 4 ° C. Transferência de 120 mL da solução worm/OP50 em cada poço de uma placa de 96 poços. Use 96 placas bem com um fundo transparente. Certifique-se manter os vermes em suspensão, enquanto pipetagem. Selar a placa usando uma fita isolante para evitar a contaminação e evaporação. Agite a placa em uma placa de microtitulação shaker por 2 min e incubar por 2 dias a 20 ° C até os animais atingirem o estágio L4. Dia 0: quinta-feira (2 semanas) antes do meio dia: Esterilizar animais adicionando Fluorodeoxyuridine (FUDR) Para esterilizar os animais adicionar 30 mL de uma solução estoque 0,6 mM FUDR a cada poço. Esta etapa traz o volume final em cada poço a 150 mL e reduz a concentração final de OP50 de 6mg / ml a 5 mg / mL (1×10 9 bactérias / mL). Selar a placa usando fita selantes e agitá-lo por 2-3 min em uma placa de microtitulação shaker. Se o OP50 foi adicionado às 2:30 no dia -2, é importante que o FUDR é adicionado antes do meio dia. Retorno placas para a incubadora de 20 ° C Dia 1: sexta-feira (2 semanas): Adicionar drogas para a cultura Por 9h00 a maioria dos animais deve ser gravid e contêm vários ovos cada. Adicionar as drogas cujo efeito no tempo de vida é para ser testado na concentração desejada. Se dissolver a droga em DMSO a concentração final de DMSO não deve exceder 0,6%, como DMSO concentrações superiores a 0,6% C.elegans encurtar sua vida útil. Após a adição da droga, selar as placas com fita isolante e agitá-lo por 2-3 min em uma placa de microtitulação shaker. Retorno placas para a incubadora de 20 ° C Adicionando as drogas podem, ocasionalmente, matar alguns animais por placa, especialmente se estiver usando um outro solvente que a água. Use um microscópio invertido para verificar se há animais mortos. Geralmente, não deve ser inferior a 10 animais mortos por placa de 96 poços. Retorno pratos para a 20 ° C incubadora. Dia 4: segunda-feira (3 semanas): selantes Alterar Para permitir que o oxigênio fresco para entrar a cultura remover o selante, espere um minuto e feche o prato. Agite a placa por 2-3 minutos em uma placa de microtitulação shaker. Repita uma vez por semana. Dia 5: terça-feira (3 semanas): Adicionar novo OP50 para evitar a fome Adicionar 5 mL da 100 mg / mL OP50 solução que foi preparada na parte 1 a cada um dos 96 poços para evitar a fome. 3. Pontuação de Lifespan. Esta seção descreve como a sobrevivência da população sem-fim sincronizado da Parte 2 é monitorada até que os animais morreram. Para observar os animais nos 96 pratos bem, use um microscópio invertido com um objetivo 2x ou 2.5x. Registro de dados de sobrevivência três vezes por semana; segunda, quarta e sexta-feira. Use movimento para determinar se os animais estão vivos ou mortos. Luz forte, luz especial azul, induz os animais a se mover. Não retire os animais mortos a partir do ensaio. Ocasionalmente, os animais que não se moveu e estavam determinados mortos na contagem anterior pode se mover mais tarde. No dia 0, no início do experimento contar o número total de vermes em cada poço. Censor poços que contêm mais de 18 animais a partir da análise como animais nesses poços não terá o suficiente OP50 e irá mostrar os efeitos da restrição alimentar. A fim de aumentar a chance de que os animais se movem agitar a placa de 96 poços em uma placa de microtitulação shaker por 2 min. antes da contagem. Em cada sessão contando data de registro e número de animais quese movem como animais vivos. Movimento em líquidos é muito mais fácil do que em meios sólidos e pode ser induzida por luz forte. O uso de uma maior ampliação pode ajudar a detectar movimentos muito sutis, como os da ponta da faringe. Tais movimentos sutis são muitas vezes o único movimento observado em animais muito velhos. Retorno placas para a incubadora de 20 ° C Repita o passo 2-4 a cada dois ou três dias até que todos os animais são mortos. 4. Resultados representante. Esta seção mostra um exemplo de como manter registros dos dados gerados por este tempo de vida do ensaio e alguns resultados representativos. Figura 1A mostra um exemplo de como gravar dados de expectativa de vida durante este ensaio. Uma folha excel é usado para rastrear a sobrevivência das populações em cada poço. Para cada bem, é coordenar na placa, a tensão, a droga, concentração da droga e do número total de animais vivos no dia 0 (X0) é gravada no início do experimento. Data de registo, bem como o número de animais mortos vivos e três vezes por semana a fim de seguir a sobrevivência das diversas populações em cada poço. Para o gráfico dos resultados, calcular a fração de animais vivos para cada dia e enredo como uma função do tempo em dias. P-valores devem ser calculados utilizando pacotes estatísticos como STATA ou software similar. A vida útil média de C.elegans é dependente da temperatura. Figura 1B mostra que as mudanças dependem da temperatura na expectativa de vida são reproduzidas exatamente pela expectativa de vida de microtitulação com base ensaio 22. Da mesma forma, o ensaio de placa de microtitulação reproduz mudanças na vida de mutantes relatado para ter tempo de vida que diferem dos animais tipo selvagem N2 23-24 25 (Figura 1C). O ensaio também pode ser usado para fazer declarações mais quantitativa. Em média Fig1D vida é plotado como uma função da concentração mirtazapina 7. Cada ponto de dados representa a vida útil média de 12/07 população, cada um vivendo de uma forma diferente também. Mesmo que o número de animais por bem é relativamente baixa (5-15 animais) a variação bem-bem é relativamente pequena, como pode ser visto a partir as barras de erro. Figura 1. A placa de microtitulação com base lifespan ensaio reproduz com precisão as mudanças na expectativa de vida relatadas na literatura. (A) Os dados da amostra coletada em uma planilha excel. Durante cada sessão data de contagem, de coordenadas do bem e do número de animais vivos e mortos foi registrado. No início do experimento, o número total de animais em cada poço foi determinado. (B) Curva de sobrevida de tipo selvagem (N2) animais cultivados a 20 ° C e 25 ° C. (C) As curvas de sobrevida de estirpes portadores de mutações que afetam a vida. Todas as quatro cepas foram testadas em paralelo a 20 ° C. (D) curva de resposta da dose de mirtazapina N2 animais tratados. A média de expectativa de vida é plotado como uma função da concentração de mirtazapina. Barras de erro indicam o EPM de 8 poços por condição. 5. Materiais. M9 buffer, 1000 mL 6 g Na 2 HPO 4 3 g KH 2 PO 4 5 g de NaCl 0,25 g MgSO 4 7H 2 O ∙ Adicione água deionizada para 1000 mL Autoclave PH Potassiumphosphate tampão 6.0, 1000 mL 136 g KH 2 PO 4 Adicionar água deionizada até 900 mL Ajustar o pH para 6,0 com KOH 5M Adicione água deionizada para 1000 mL Autoclave Traço solução de metal 1,86 g Na 2 EDTA 0,69 g FeSO 4 7H 2 O ∙ 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O 0,29 g ZnSO 4 7H 2 O ∙ 0,016 g CuSO 4 1000 mL de água deionizada Autoclave e armazenar no escuro. S-basal média, 1000 mL 5,9 g NaCl 50 mL de fosfato de potássio 1M, pH 6,0 1000 mL de água deionizada Autoclave Deixe a solução arrefecer e adicionar 1 mL de colesterol 5mg / mL (dissolvido em Et-OH). 1M citrato de potássio, 1000 mL 268,8 g de citrato tripotássio 26,3 ácido cítrico Adicionar 900 mL de água deionizada Ajustar o pH para 6,0 com KOH 5M Adicione água deionizada para 1000 mL Autoclave S-médio completo, 1000 mL 977 mL S-basal 10 mL de citrato pH 1M de potássio 6 (estéril) Rastreamento 10 mL de solução de metais (estéril) 3 ml 1M CaCl 2 (estéril) 3 mL 1M MgSO 4 (estéril) Agar NGM 3.0G NaCl 2,5 g peptona(Pancreático de caseína, digerir) Agar 17g Adicionar água deionizada para 975 mL e uma barra de agitação Autoclave Após autoclavagem arrefecer a 55 ° C e adicionar os seguintes componentes: 0,5 mL de CaCl 2 1M (estéril) 1 mL de Colesterol 5mg / mL em etanol 1 mL de 1M MgSO 4 (estéril) 25 tampão Potassiumphosphate mL, pH 6,0 (estéril) TB, 1000 mL 12g Bacto Triptona Extrato de levedura 24 g 4 mL de glicerol Adicionar 900 mL de água deionizada Autoclave Após autoclavagem arrefecer a 55 ° C e adicione o componente seguinte: adicionar 100 mL de 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 0,6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma # cat F0503), 1000 mL 100 mg FUDR Dissolver em 670 mL estéreis S-completar, fazer 10 mL ou 45 mL alíquotas. Armazenar a -20 ° C. 100 mg / mL carbenicilina, 10 mL 1 g carbenicilina 10 mL de água deionizada estéril Estéril filtrado e alíquota Armazenar a -20 ° C. Use a uma concentração final de 50 mcg / mL 250ug / ml anfotericina B, 4 mL 1mg anfotericina B 4 mL Et-OH Armazenar a -20 ° C Use a uma concentração final de 0,1 mg / mL