Dissezione di Human Elements corpo vitreo per l'analisi proteomica

1. Segmento dissezione anteriore. La cornea viene rimosso facendo prima un'incisione al limbus, in camera anteriore con una lama di 15 ° (Figura 1). Poi una lama ricurva di cornea-sclerale forbici viene inserito nella camera anteriore. Circonferenziale tagli sono fatti a cornea, appena anteriormente al limbus. 0,12 Colibri pinze e forbici Westcott sono usati per tagliare l'iride circonferenza anteriore del corpo ciliare. Il nucleo dell'obiettivo sia stato rimosso con pinza 0,12 Colibri o una lama di 15 ° (supersharp) e la corteccia e la capsula con le pinze. 2. Nucleo aspirazione vitreo. Un 23-gauge a 5-cc siringa è inserita nella metà del vitreo (Figura 1). Circa 1 ml o più di nucleo vitreo è delicatamente aspirato. Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. 3. Anteriore Hyaloid Dissection. Il hyaloid anteriore è visto come un semi-anello trasparente regolando la luce incidente da una luce microscopio collo d'oca. Aspirazione precedente del nucleo vitreo separa il hyaloid anteriore da altre strutture per una più facile identificazione. Il foglio di tessuto elastico viene accuratamente tirato fuori dal corpo ciliare con Colibri o pinze spogliatoio e tagliato con le forbici Vännäs. Questa manovra viene ripetuta. Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. 4. Base Dissection vitreo. Utilizzando 0,12 pinze per stabilizzare l'oculare, forbici Westcott sono usati per "fiore" l'occhio facendo quattro equidistanti antistress tagli dal corpo ciliare verso la testa del nervo ottico. La pars plicata del corpo ciliare (Figura 2) viene rimosso da ciascuno dei quadranti con le forbici Westcott. La base del vitreo viene poi afferrato su entrambi i lati della serrata con una pinza il pars plana e la retina (Figura 2). Trazione continua sulla base del vitreo è applicato con le pinze. Taglio sequenziale con le forbici Westcott estratti di un semi-trasparente tessuto con un aspetto "filo di perle", come viene asportato. Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. 5. Cortex rimozione vitreo. La pars plana è asportato da ciascuno dei quadranti Westcott con le forbici, tagliando il foglio di circa 3 mm posteriormente al serrata (Figura 2). Tra i volantini dei tessuti, la corteccia vitreo è visualizzato come una pellicola semi trasparente. Il film elastico può essere afferrato con pinze 0,12 o detenuti da adesione ad una Weck-Cel spugna chirurgica. La corteccia vitreo è poi tirato via dalla retina e asportato con le forbici Westcott (Figura 1). Il campione è posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. Tutti i campioni sono conservati a -80 ° C fino al momento utilizzato per la sperimentazione. 6. Rappresentante Risultati Campioni di tessuto possono essere elaborati da una varietà di metodi per esperimenti specifici. Nel nostro caso, i campioni sono stati sottoposti ad analisi delle proteine ​​mediante SDS-PAGE (Figura 3). Figura 1. Vista in sezione trasversale dell'occhio umano raffigurante sottostrutture diverse del corpo vitreo. Il vitreo più anteriore è un sottile strato di collagene chiamato hyaloid anteriore. Il nucleo vitreo comprende l'intera regione centrale del corpo vitreo. Questa porzione del vitreo è più acquoso in contrasto con la base del vitreo, che è abbastanza viscoso per essere afferrato con pinze ed è saldamente attaccato al corpo ciliare e la retina sottostante. Che comprende il nucleo vitreo è un guscio molto sottile collagene chiamata corteccia vitreo. Figura 2. Anatomia base del vitreo. La base del vitreo è un semi-trasparente sottostruttura del corpo vitreo situato lungo la serrata (frecce bianche), che è la linea di demarcazione che separa il corpo ciliare e la retina. Il margine anteriore della base del vitreo si estende su la pars plana (linea bianca) del corpo ciliare. Il bordo posteriore della base del vitreo si estende 2-3-mm posteriormente al serrata (trattino bianco). Per accise base del vitreo, pinze sono utilizzati per afferrare il tessuto e tirarlo via dal corpo ciliare e la retina sottostante. Una volta elevato, forbici Westcott sono usati per tagliare lungo la base. Figura 3. Monodimensionale SDS-PAGE di elementi del corpo vitreo. Concentrazioni di proteine ​​totali del hyaloid anteriore, base del vitreo, vitnucleo reous, e la corteccia vitreo sono stati 11,24, 20.1, 16,61, 14,24 mg / ml, rispettivamente. Elettroforesi su gel è stata effettuata a 200 kV per 45 minuti, colorati con Flamingo (Bio-Rad), e visualizzati utilizzando un sistema VersaDoc Imaging (Bio-Rad). I profili per i diversi tessuti mostrano diversi gruppi simili, indicando sia conservata o cross-contaminazione delle proteine, così come unica band (asterisco), indicando proteine ​​differenzialmente localizzate.