재조합 RBD 기반 SARS 백신에 대한 프로토콜 : 단백질 준비, 동물 예방 접종 및 중화 감지

1. 재조합 SARS – CoV RBD 단백질 준비 칼슘 인산염 transfection 시약 준비 2X HBS 버퍼 준비 : 함께 NaCl의 16g, 나 2 HPO 4 * 7H 2 O의 0.4 g, 그리고 HEPES의 13.0 g를 섞습니다. 7.00로 산도를 조절하고 증류수 1000 ML에 총 볼륨을 가져 오십시오. 살균, 나누어지는에 대한 솔루션을 필터링 및 -20 ° C.에서 저장 후 힌트 : 산도 가치의 모든 변동은 transfection 결과에 영향을 미치지합니다. 따라서 그것은 7.00 (예를 들어, 6.99, 7.00, 또는 7.01) 주위 여러 ​​산도 값을 테스트하고 아래에 소개된 방법을 사용하여 transfection에 가장 적합한 하나를 찾을 것을 권장합니다. 2.5 M CaCl 2 준비 : 200 ML의 최종 볼륨 증류수에 CaCl 2 * 2 시간 2 O의 73.5 g을 추가합니다. -20 ° C.에 솔루션 및 상점 필터 재조합 플라스미드 transfection하여 단백질 정화 transfection 전에 confluency 24 H는 50~70%에서 293T 세포 분할. 40 ML DMEM는 FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S) 37 10 % 열 inactivated (HI)를 포함 ° C를 5% CO 2의 T – 175cm 두 조직 문화 flasks에 세포를 성장. 모든 transfection의 시약은 transfection 전에 상온까지 가지고 있어야합니다. 이 시약은 2X HBS, 2.5M CaCl 2, DiH 2 O, 그리고 rRBD 플라스미드 6 포함되어 있습니다. 힌트 : 단백질 표정은 문화 뜨는로 표현 재조합 단백질의 분비를 보장하기 위해 신호 펩티드를 포함해야합니다에 대한 최종 재조합 플라스미드를 사용 제작합니다. 배의 그의 태그는 쉽게 정화를위한 표현 단백질의 C – 터미널에 추가할 수 있습니다. 한 50 ML (A) 한 15 ML (B) BD 팰컨 튜브를 준비하고, 같은 표 1에 표시된 튜브에 시약을 추가합니다. 튜브 B에 관 A.에 2X HBS 버퍼를 추가 2.5M CaCl 2를 추가하고 플라스미드 rRBD, 그리고 DiH 2 O.의 요구 사항에 볼륨을 가지고 A. 하나의 T – 175cm 두 조직 문화 플라스크 (4000 μL / 술병) : rRBD 표현을위한 준비 튜브 튜브 B 2X HBS 2000 μL 2.5M CaCl 2 200 μL rRBD 플라스미드 DNA 40 μg DiH 2 O로 2000 μL B. 하나의 100 – mm 배양 접시 (1000 μL / 접시) : 사스 pseudovirus 생산을위한 준비 튜브 튜브 B 2X HBS 500 μL 2.5M CaCl 2 50 μL SARS – CoV S 플라스미드 DNA 5 μg (pNL4 – 3.luc.RE) HIV – 1 플라스미드 5 μg DiH 2 O로 500 μL 표 1. Transfection 혼합물의 준비와 볼륨 표 1에 나열된 볼륨 하나 transfection 유닛위한 것입니다. 더 flasks이나 요리가 transfection에 사용하는 경우 적절하게 볼륨을 조절할 수 있습니다. 와동에 지속적인 부드러운가 혼합 유지하면서, 튜브 dropwise 방식에 관 B의 DNA – 칼슘 솔루션을 추가합니다. 혼합물은 20-30 분 실온에서 앉아 보자. 성공적인 칼슘 인산염 transfection에 대한 열쇠는 형성 촉진의 크기와 모양에 따라 달라집니다. 따라서 혼합물은 그 결과로 transfection의 효능을 향상시키고,이 요건을 충족하기 위해 지속적으로 천천히 vortexed하고 있어야합니다. 293T 세포 (4000 μL / 플라스크)에도 dropwise와 방식으로 혼합을 추가합니다. 37 인큐베이터 문화 전지 ° 5% CO 2에서 C. 신선한 혈청이없는 OPTI – 멤 I 감소 – 세럼 중간 (50 ML / 술병) 80-10 H 게시할 – transfection있는 문화 매체를 교체합니다. 같은 조건으로 이틀 더 문화 세포로 진행합니다. 뜨는 포함하는 표현 rRBD 단백질 72 H 포스트 – transfection를 수집합니다. 세포 파편을 제거 15 분 6,000 rpm으로 원심 분리기. 4 ° C 하룻밤에 수집된 뜨는 및 저장 프로 테아제 억제제 칵테일을 추가합니다. 다음날, 니켈 – NTA의 Superflow 다음과 같은 제조 업체의 지침을 사용하여 문화 뜨는에서 rRBD 재조합 단백질 정화. Amicon 울트라 -15 농도 튜브를 사용하여 단백질을 정화 집중. 단백질 농도 후,농도 튜브에 PBS를 추가하고 용출 버퍼에 이미다졸을 제거하는 다시 원심 분리기. ° C를 사용하기 전까지 -80에서 단백질을 정제 단백질 농도 및 저장을 계산합니다. 2. 마우스 예방 접종 및 샘플 수집 40-45 사전 따뜻한 시그마 도움이되는 시스템 (SAS) ° C 제조 업체의 지시에 따라. 유리병 당 1 ML PBS를 추가하고 철저히 섞는다. 표 2의 프로토콜에 따라 도움이되는 단백질의 감광 유제를 준비합니다. 피펫은 1.5 ML 튜브에 rRBD 단백질을 풀었다. 튜브 및 유제를 형성하기 위해 2-3 분 적극적으로 와동에 SAS 도움이되는 동등한 볼륨을 추가합니다. 힌트 : 표 2에 나열된 볼륨 한 마우스입니다. 사용되는 실제 마우스 번호에 따라 볼륨을 조정합니다. 각 그룹에 대한 각 백신에 필요한 단백질과 도움이되는 함께 섞는다. 항상 정확성을 보장하기 위해 예방 접종을 한 여분의 샘플을 준비합니다. 그룹 1 일 백신 (200 μL / 마우스) 2 차 예방 접종 (200 μL / 마우스) 제 3 백신 (200 μL / 마우스) rRBD 단백질 PBS 20 μg 단백질 (100 μL) + 100 μL SAS PBS 10 μg의 단백질 (100 μL) + 100 μL SAS PBS 10 μg의 단백질 (100 μL) + 100 μL SAS PBS 제어 100 μL PBS + 100 μL SAS 100 μL PBS + 100 μL SAS 100 μL PBS + 100 μL SAS 표 2. 마우스 예방 접종 프로토콜 Subcutaneously 프라임 – 면역 여성 BALB / C 마우스 (오래된 4-6주, 5 마우스 / 그룹) 및 rRBD 및 SAS와 배 향상은 표 2에서 지적했다. 컨트롤로 PBS 그룹을 사용합니다. 일반적으로 선택한 피하 주사에 대한 사이트는 양어깨 사이의 느슨한 피부이다. 또는 복부 복부는 그것이 주사 쉽게되기 때문에 일반적으로 사용되며, 사출 사이트에서 어떠한 누수를 관찰 수 있습니다. 백신의 반복 복용을 사용하는 경우, 그것은 잠재적인 지역의 피부 반응을 방지, 각종 사출 사이트를 선택 쉽습니다. ° C 30 분 보완을 inactivate하는 56 각 예방 접종 후 예방 접종을 10 일 전에 마취와 함께 복고풍 – 궤도 및 열을 세라를 통해 쥐를 출혈. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관 마우스 세라. 3. Pseudovirus의 중화 분석을 사용하여 중화 감지 사스 pseudovirus 준비 transfection 전에 (2×10 6 셀 / 요리) 100mm 조직 문화를 배양 접시에서 16 H를 293T 세포를 분리하고, 상기 세포를 성장. 로 표 1에 표시된 transfection의 시약을 준비합니다. 공동 transfect 플라스미드 인코딩 SARS – CoV S 단백질과 플라스미드 인코딩 환경을 – 결함, 루시페라제 – 표현 HIV – 1 유전자 (pNL4 – 3.luc.RE) 칼슘 인산염 transfection 시약을 사용합니다. 10 ML 신선한 DMEM 10 % FBS, 1 % P / S 80-10 H 포스트 transfection을 포함와 매체를 대체합니다. 뜨는 포함 사스 pseudovirus 72 H 포스트 – transfection를 수집합니다. 0.45 μm의 필터를 통해 필터 pseudovirus. -80에서 나누어지는하고 저장 ° C까지 사용. 사스 pseudovirus의 중화 분석 16 H 감염 전에 96 잘 조직 배양 플레이트 4 cells/100 μL / 음 10 SARS – CoV 수용체 ACE2 (ACE2/293T)를 표현 293T 세포를 분할. ACE2/293T 세포에서 바이러스 titer를 감지 2 배로 사스 pseudovirus을 희석. 순차적으로 96 – 웰 조직 문화 접시에 마우스 세라를 희석하고, titrated 사스 pseudovirus 동등한 볼륨을 추가합니다. 1 H.위한 37 ° C에서 접시를 Preinc​​ubate 부화 후, ACE2/293T 세포에 세라 – pseudovirus 혼합물 100 μL를 추가하고, 37 세포의 성장을 계속 ° C를 5% CO 2인치 나중에 신선한 DMEM 24 H를 추가합니다. 완전히 문화 supernatants는 접시에서 72 H 게시 – 감염을 제거합니다. 1X 루시페라제 세포 배양 용해 시약 (물론 60 μL /)를 추가하고 지속은 실온에서 1-2 H에 대한 번호판을 잡고 세포 용해를 촉진. luminometer 플레이트로 전송 세포 lysates (물론 50 μL /) (Microfluor 96 – 웰 플레이트). 루시페라제 분석 시스템에 포함된 루시페라제 기판 (50 μL / 음) 추가하고 울트라 384 luminometer에서 상대 루시페라제 활동을 감지합니다. 50% 중화 항체 titer (NT 50) 6 등 사스 pseudovirus의 중화 titer와 선물을 계산합니다.